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1、史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：http:item.taobaocom/itemhtm?id=9176907081史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：http:item.taobaocom/item.htm?id=9176907081脂质体电动色谱用于评价药物透皮吸收王永军，刘洪卓，孙进，孙英华，刘晓红，何仲贵(沈阳药科大学药学院生物药剂学研究室，辽宁沈阳，110016)摘要：目的采用脂质体电动色谱法对药物透皮吸收进行评估。方法测定22个不同种类 化合物的保留因子(化)，采用逐步回归法在药物透皮参数(logKp)和logk及其它简单理化参数 之间建立定量保留活性关系(q
2、uantitative retention-activity relationships, QRARs)。结果 建立 了药物透皮参数(logKp)和logk、分子量、化合物OH、NH键数目之和之间的相关方程，相 关系数R2 = 0.902。结论 脂质体电动色谱在预测药物透皮系数方面展现了良好的应用前景。 关键词：脂质体；电动色谱；透皮参数；逐步回归Predicting skin permeability using liposome electrokinetic chromatogrpphyYongjun Wang, Hongzhuo Liu, Jin Sun, Yinghua Sun, Xi
3、aohong Liu, Zhonggui HeABSTRACT: OBJECTIVE To estimate drug penetration through skin using liposome electrokinetic chromatography. METHODS The retention factor of twenty-two structure diversely compounds were determined, quantitative retention-activity relationships were constructed between skin per
4、meation coefficients and logk and other physicochemical parameters by stepwise regression method. RESULTS a quantitative retention-activity relationships (QRARs) was constructed between compound skin permeability coefficient (logKp) and log k, molecular weight, the counts of OH and NH of molecule by
5、 stepwise regression method (R2 = 0.902). CONCLUSIONS In a word, LEKC is a promising rapid tool to predict drug penetration throughskin.课题获国家自然科学基金No. 30400563和辽宁省自然科学基金No. 20052058资助。作者简介：王永军，男，沈阳药科大学药剂系讲师，博士。email： i_ 通讯作者：何仲贵，男，沈阳药 科大学药剂系教授。Tel: (024)23986320，email:KEYWORDS liposome; electrokinet
6、ic chromatography; skin permeation coefficients; stepwise regression借助毛细管电泳仪，把脂质体溶液加入到毛细管中作为运行溶液，脂质体作 为一种假固定相(pseudostationary)，加压运行后，测试溶质依靠其自身的电泳属 性以及分配进入脂质体程度的不同而分离，称之为脂质体电动色谱 (liposome electrokinetic chromatography, LEKC)。LEKC 作为一种定量分析技术，不具有什 么特别的优势，但由于脂质体的组成、结构及性质与生物膜的相似性，脂质体作 为一种类生物膜，用于研究药物与生物膜
7、的相互作用时有其独特的优势。目前对 于LEKC的研究报道主要集中在基础研究方面，包括脂质体在毛细管电泳中的 迁移机制U-3】，LEKC中药物与脂质体的作用机制等方面4-刀，应用研究报道较少 8-9。当前，药物化学高速发展，化合物数目急剧增加，同时中药中蕴含数目庞大 的天然化合物，这些都使得适宜体内药动学特征的药物筛选成为新药开发的瓶 颈，脂质体同天然生物膜结构上的相似性与毛细管电泳的快速高效性相结合，为 突破这一瓶颈提供了强有力的工具。皮肤由表皮、真皮和皮下组织三部分组成，此外还有汗腺、皮脂腺、毛囊等 附属器。表皮由内向外可分为五层，即基层、棘层、粒层、透明层和角质层，其 中表皮中的角质层性质
8、与其它各层有较大差异，是药物透皮吸收的主要屏障。角 质层主要由角蛋白和脂类成分组成，这些脂类成分包括磷脂、鞘磷脂、胆固醇和 一些脂肪酸。角质层中不存在主动转运的活性蛋白，完全是一个被动转运的屏障。 因此，我们有理由认为药物的透皮吸收与其亲脂性密切相关。本文收集了 22个有皮肤渗透系数(logKp)的化合物，拟在药物在LEKC上的保留因子和透皮参数之间建立一种定量保留一活性关系，用于预测未知化合物 的透皮吸收，初步考察它们与透皮参数的相似性。1实验条件1.1试药、试剂及仪器试药：苯、间苯二酚、氢化可的松、酮洛芬、双氯芬酸等为沈阳药科大学药 剂、药分教研室提供。试剂：蛋黄磷脂(磷脂酰胆碱含量97.
9、5%，PC)，购自上海东尚实业有限公 司；大豆磷脂酰丝氨酸(磷脂酰丝氨酸91.9%，PS)，氢化磷脂(HPC)，胆固醇 (Chol)，购自北京百威昂医药技术开发有限公司；Polybrene(PB)、dextransulfate(DS) (MWav = 500 000)、壬基苯酮，购自 Aldrich-Sigma 公司；三羟甲基 氨基甲烷(Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES )购自，二甲基亚飒(DMSO)、甲 醇等均为分析纯试剂。仪器：JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；LS 230型激光衍 射粒径分析仪(贝克曼一库尔特公司)；HPCE-10毛细管电泳仪(大连江申分离
10、科 学技术公司)。1.2电泳条件熔融石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司)，总长43cm，进样端距 检测窗38cm，内径50pm；温度：室温；电压：+1020kV；检测波长210nmo全新熔融石英毛细管的预处理：1M NaOH溶液冲洗30min； 0.1M NaOH溶 液冲洗10min ；重蒸水冲洗20min。涂层毛细管的制备：将全新熔融石英毛细管预处理后，以5%PB溶液冲洗 15min，静置10min；以3%DS溶液冲洗15min，静置30min，重蒸水冲洗10min 备用。1.3脂质体的制备称取适量磷脂至250mL圆底烧瓶中，加入氯仿一甲醇(9:1，V/V) 10mL溶 解；60水浴减
11、压蒸馏30min除去有机溶剂；将预热至60C的20mM的pH5.5 磷酸盐缓冲溶液加入烧瓶中，水化分散；探头超声20min，参数设置为超声3s，间歇2s,功率200W；然后经0.22- urn微孔滤膜过滤，充氮气4。条件下冷藏备 用。1.4溶质在LEKC上保留因子的计算usk =(Eq.(1)(te()(1 -) lipk =(。一顼Eq. (2)t(t (1 -广)lip公式1、2分别为中性和荷电溶质保留因子的计算公式，tr、y t如分别为溶 质在LEKC上的出峰时间、电渗流出峰时间(甲醇、二甲基亚飒等标记)、脂质 体出峰时间(壬基苯酮等标记)，t0为带电溶质在CZE下的运行时间。2结果与讨
12、论2.1定量保留-活性关系的建立为建立一种定量保留一活性关系，用于预测未知化合物的透皮吸收，收集了 22个有皮肤渗透系数(logKp)的化合物，分别采用含有胆固醇脂质体和不含有胆 固醇脂质体测定其LEKC保留因子，结果见表1。表 1 Tab. 1对logkChol或logk与logKp之间进行相关性研究，没有发现它们之间有显著 的相关性。Lien等人曾报道如下的logKp预测模型，见Eq. (4-2)。logKp = kJogP + k2MW + k3Hb + k4Eq. (3)logP为正辛醇/水分配系数，MW为分子量，Hb指代的是化合物氢键的数目，k k2、k3为回归系数，k4为回归常数。
13、为建立化合物LEKC保留因子与logKp之间 的预测模型，我们引入了 MW/100、OsNs、OHsNHs、PSA等理化参数，以逐步 回归方法剔除不显著的参数，最后引入的参数中只保留了 MW/100和OHsNHs， 回归结果见下：0.20(0.18)0.10(0.19)0.37(0.31)logKp = 0.42(0.13)logkChol - 0.92(0.09)看-0.37(0.08)OHsNHs +Eq.(4)R2 = 0.935, SE = 0.379, n = 22MWp = 0.44(07岫-0.89。10) 100 - 0.40(0.09)朋用 +Eq.(5)R2 = 0.923
14、, SE = 0.410, n = 22为与正辛醇/水系统作以比较，同样进行回归处理，结果如下：、 MW 岫=0.19(0E-爵7而-0.26(0.13)OHsNHs -Eq.(6)R2 = 0.911, SE = 0.441, n = 22从上述等式看，以含有胆固醇脂质体的LEKC建立了最好的相关模型，即 Eq.，因为Eq.有着最高的相关系数(R2 = 0.935)和最小的均方根误差(SE = 0.379)；而以正辛醇/水系统建立的模型相对较差，因为Eq.(6)有着最大的均方 根误差(SE = 0.441)和最低的相关系数(R2 = 0.911)。从等式的系数看，log*、logP与logK
15、p正相关，而MW/100、OHsNHs与logKp 负相关。因为log*、log尸是化合物的亲脂性参数，这也正说明了化合物的亲脂 性增加更有利于其渗透进入皮肤，而亲水性的化合物则不易渗透进入；MW/100 代表的是分子体积，描述的是分子体积对其从水相分配进入生物膜及通过生物膜 扩散的影响；OHsNHs指代的是化合物分子的氢键供体数目，与logKp的负相关 说明化合物分子氢键供体数目增加不利于其渗透进入皮肤。2.2模型验证由于所收集的化合物数目较少，只有22个，不足以分为测试集和验证集对 相关模型进行验证，所以我们采用了 leave-one-out的方法进行模型验证。所谓 leave-one-out模型验证就是在总的数据(n)中去掉一个数据，用余下的数据(n-1) 建立模型来预测去掉的这个数据，如此类推，经过n次迭代计算，即可获得n 个预测数据，将原试验值与测试值进行相关比较来考察所建立模型的预测能力。 采用该方法分别对Eq. (4)、Eq. (5)、Eq. (6)进行模型验证，各预测值见表2,相 关散点图见图1、2、3。表 2 Tab. 2图 1 Fig! 图 2 Figi 图 3 Figi从图1、2、3可看出，基于LEKC建立的Eq. (4)预测的logKp值与试验值 有最好的相关性(R2 = 0.934)，而基于正辛醇/水系统建立的Eq.的预测能力相
