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1、1.DNA测序样品的要求 2.常用载体特征 3.PCR类型测序模板注意事项 4. DNA测序常见问题分析及解决办法总结5. 测序常见问题分析DNA测序样品的要求未纯化PCR产物的要求1. 片段大于200bp；2.请提供50ul PCR扩增产物(总量1ug-2ug)；3.取3ul样品，应该能够清晰的分辨出目的条带； 自带引物，引物浓度不低于5uM,并请注明。 备注纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)；2.浓度大于20ng/ul，体积大于10ul，长片段需适当增加量；3.电泳检测条带专一； 自带引物。 所有模板均应提供相应的引物信息自带质粒的要求1.质粒溶于30
2、50ul ddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)，电泳检测浓度大50ng/ul；2. 建议用相关试剂盒提取质粒；3. 如有可能，同时提供1ml含有相应质粒的菌液备用； 4. 需注明载体和插入目的片段长度、以及测序要求。 菌样模板的要求1.说明载体抗性类型，我们提供Amp, Kan, Tet及Chl四种抗生素；2. 其余类型抗生素需自备；应为高拷贝质粒，对于低拷贝质粒，请直接提供约1mg纯化质粒；3. 提供1ml左右过夜培养（12h）的菌液，加15%灭菌甘油，于Eppendorf管中封口保存，防止交叉污染或渗漏；4. 大量样品测序，建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养；5. 建议尽量提供穿刺
3、培养或斜面培养的菌种（装在EP管中）。自带引物的要求1.浓度不低于5pmol/ul(或5umol/L)，溶液体积15-50ul；2. 随机引物（RAPD引物）和简并引物以及引物长度不足15bp不能用于测序；3. 尽可能提供引物全序列、PCR退火温度，以供参考。 本公司提供如下通用测序引物： M13+，M13-，T7, SP6, T7 ter，BGH rev, pGL3+, pGL3-，pGEX5，pGEX3， 5AOX，3AOX ，a-factor。 其他引物请自带或提供序列由我们合成。 常用载体特征载体大小抗性标记测序引物备注pALTER-15676bpamps, tetrT7, SP6pA
4、LTER-Ex5835bpamps, tetrT7, SP6, T7 ter, pALTER-MAX5534bpamps, cmrT7, T3 pBluscript2950bpampM13-,T3/ T7,M13+pBK-CMV4513bpkan, tetT7, T3pBR3224363bptetpBR primerPromegapcDNA 3.15.4kbamp, neoT7,BGH rev.pCEP410.4kbampM13+/M13-pCI-neo5472bpamp, kanT7, T3PromegapCR2.13.9kbamp, kanM13+/M13-, T7InvitrogenPC
5、R3.15060 bpamp, kanT7, BGH Rev.InvitrogenpEF6/v5-His-TOPO5840bpamp T7,BGH rev.InvitrogenpET-15b5708bpampT7, T7terpET-28a-c(+)5369bpamp T7, T7terpGEM-T vector3000bpampM13+,T7 / SP6,M13-PromegapGEM xZ series3000bpamp SP6, T7PromegapGEMEXx series4000bpampT7ter,SP6, T3, T7PromegapGL3-basic4818 bpamppGL3
6、-/pGL3+PromegaPLNCX26.1kbClontechPLXSN5.9kbClontechpT-Adv3.9kbamp, kanM13+/M13-, T7pT7Blue2887bpampT7, M13+/M13-NovagenpTriplEx 23.6kbampT7ClontechPTYB1,2,3,4T7pUC18/19 2686bpampM13+/M13-pUC118/1193200bpampM13+/M13-pUCm-T2773 bpamp M13+,T7/M13- TakarapSelect-1 5680bptetSP6,T7,M13+/M13-pSP系列 18-65300
7、0bp,ampSP6,T7pSP系列 70-732450bpampSP6,T7Promega pT3/T7ampT3,T7M13mp18/19 RF7249bp无M13+/M13-TaKaRapMD 18-T vector2692bpampM13+/M13-TaKaRapKF3 2246bpchlpKF3 primerTaKaRapKF 18k2204bpkanM13+/M13-TaKaRapTZ19U pTZ19R2862bpamp M13+/M13-TaKaRagt10 system43340bp无gt10 primerTaKaRagt11 system43340bp无gt11 prime
8、rTaKaRaPCR类型测序模板注意事项 总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。 对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR产物作克隆后进行测序。有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。 经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。有多种纯化方法可供选择
9、，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。 与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。 PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。 纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。 若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp 各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并
10、将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。 引物浓度的换算关系总ng数 = pmole x 分子量/1000 由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。DNA测序常见问题分析及解决办法总结常见问题具体情况可能的原因处理办法备注样品准备问题菌培养不好或失败抗性不对或菌已死核对抗性，尽可能提供载体信息。或菌培养条件特殊重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。质粒提不出质粒拷贝数极低或客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。培养方式不当质粒产量很低低拷贝数质粒或客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。培养方式不当自带质粒或已纯化PCR产物量极低是否为电泳法定量
11、，质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。测OD值法不可靠,电泳检测总量是否足够已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。测序出现双峰或信号中断双峰重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复用反向引物测互补链。此类问题主要与样品有关质粒测序在插入序列中出现套峰可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。PCR产物测序中，某一点后序列变乱可能是存在移码突变，这是正常的，也可以克隆后测序。PCR产物中一个或多个位置有套峰序列中存在突变，这是正常的，也可以克隆后进行测序。PCR产物测序前部分双峰引物二聚体污染或产物不
12、纯，克隆后测序。质粒测序时整个结果双峰引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。质粒和PCR产物测序出现双峰引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。信号迅速衰减或中断模板GC二级结构区后难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序模板GT二级结构区后测反向互补序列，AC结构不影响测序严重的重复结构测反向互补序列模板特性决定的根据具体情况决定信号极弱或无信号模板质量差重新提供菌液或纯化PCR产物质粒样品：引物不符尽量提供载体详细信息，核查引物引物不适宜测序测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不
13、能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序质粒产量极低客户自己提供2ug纯化好的质粒PCR产物定量极低重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化测序结果正常，与预期不符找不到引物质粒模板检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。PCR模板不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。结果完全不对请提供详细资料我们会根据结果具体分析。测序
14、常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多： PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。在最后一个碱基A后，信号会迅速减弱。因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。 在序列的起始端有时会有一些N值。该种情况主要是有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器将无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导
