工学酶工程第3章兰州大学酶工程酶的分离纯化ppt课件

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1、第三章 酶的分别纯化一、提取一、提取二、分别纯化二、分别纯化 大规模提取纯化的特殊性 在在选选择择酶酶的的提提取取和和分分别别纯纯化化方方法法时时，必必需需思思索索到到小小规规模模工工艺艺过过程程和和大大规规模模工工艺艺过过程程之之间间的的关关系系。酶酶的的提提取取和和分分别别纯纯化化方方法法有有多多种种，但但并并不不是是都都适适宜宜大大规规模模的的操操作作过过程程。例例如如超超声声波波处处置置、冻冻融融、研研磨磨等等方方法法能能有有效效地地破破碎碎细细胞胞，但但是是扩扩展展这这些些技技术术的的运运用用规规模模，多多数数是是不不适适用用的，有些也效果不佳。的，有些也效果不佳。 胞外酶的提取 微

2、微生生物物产产生生的的酶酶分分为为胞胞内内酶酶和和胞胞外外酶酶，胞胞内内酶酶还还分分为为游游离离形形状状和和膜膜结结合合形形状状两两类类。要要得得到到胞胞内内酶酶，必必需需首首先先破破碎碎细细胞胞，使使酶酶从从细细胞胞内内释释放放出出来来，进进入入提提取取液液中中，以以后后的的分分别别纯纯化化步步骤就与胞外酶差不多了。骤就与胞外酶差不多了。 一、提取 提提取取指指的的是是使使酶酶从从细细胞胞中中释释放放出出来来，进进入入提提取取液液的的过过程程。提提取取普普通通在在低低温温下下进进展展，低低温温有有利利于于坚坚持持酶酶的的活活性性，也也能能减减少少蛋蛋白白酶酶对对目目的的酶酶的的水水解解。提提

3、取取液液要要有有适适当当的的pHpH值值和和离离子子强强度度，通通常常用用一一定定浓浓度度的的缓缓冲冲液液作作为为提提取取液液，根根据据情情况况还还可可以以参参与与一一些些酶酶活活性性的的维维护护剂剂和和蛋蛋白白酶酶抑抑制剂。制剂。 酶活性维护剂 牛牛血血洁洁白白蛋蛋白白BSABSA，bovine bovine serum serum albuminalbumin、明明胶胶、甘甘油油、二二硫硫苏苏糖糖醇醇DTTDTT、谷谷胱胱甘甘肽肽GSHGSH、巯巯基基乙乙醇醇、金金属属离离子子、EDTAEDTA。蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 苯苯 甲甲 磺磺 酰酰 氟氟 PMSFPMSF 、 抗抗 蛋蛋 白白

4、 酶酶 antipainantipain、亮抑酶肽、亮抑酶肽leupeptinleupeptin等。等。 1 1化学方法提取化学方法提取1 1碱碱2 2溶菌酶和溶菌酶和EDTAEDTA3 3去垢剂提取去垢剂提取4 4浸透冲击浸透冲击1 1碱提取碱提取 这这种种方方法法用用在在各各种种细细菌菌的的小小规规模模和和大大规规模模提提取取中中都都相相当当胜胜利利。在在提提取取治治疗疗用用的的L-L-天天冬冬酰酰胺胺酶酶时时，将将细细菌菌置置于于pH11pH1112.512.5的的碱碱液液中中处处置置2020分分钟钟可可将将酶酶提提取取出出来来。碱碱处处置置能能否否适适用用取取决决于于目目的的酶酶在在高

5、高pHpH下下的的稳稳定定性性。此此法法可可以以使使蛋蛋白白酶酶失失活活，还还可以减少医用酶制剂的热源污染。可以减少医用酶制剂的热源污染。 2溶菌酶和EDTA提取 溶溶菌菌酶是是用用鸡蛋蛋清清作作原原料料消消费的的商商品品酶，它它专注注水水解解细菌菌细胞胞壁壁粘粘肽也也叫叫肽多多糖糖部部分分的的-1,4-1,4-糖糖苷苷键，细胞胞壁壁刚性性强的的革革兰氏氏阳阳性性细菌菌对这种种酶的的敏敏感感性性要要比比革革兰氏氏阴阴性性细菌菌高高，由由于于细胞胞壁壁的的刚性性在在很很大大程程度度上上是是来来自自细胞胞壁壁的的粘粘肽。当当细胞胞壁壁崩崩解解后后，最最终使使细胞胞外外膜膜破破裂裂的的是是提取液的浸

6、透提取液的浸透压。2溶菌酶和EDTA提取 单单独独运运用用溶溶菌菌酶酶破破碎碎革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌的的细细胞胞壁壁很很难难获获得得胜胜利利，EDTAEDTA是是必必需需的的添添加加物物，由由于于EDTAEDTA能能螯螯合合维维持持细细胞胞壁壁稳稳定定必必需需的的二二价价阳阳离离子子，可可使使革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌细细胞胞外外膜膜上上的的脂脂多多糖糖释释放放出出来，这样使溶菌酶可以进入并且作用于粘肽层。来，这样使溶菌酶可以进入并且作用于粘肽层。 这这项项技技术术很很少少用用于于细细菌菌酶酶的的大大规规模模提提取取，由由于于溶溶菌菌酶酶的的价价钱钱较较高高。粗粗制制鸡鸡蛋蛋清清要要廉

7、廉价价得得多多，而而且且经经常常同同样样有有效效。溶溶菌菌酶酶法法是是一一种种使使细细胞胞破破裂裂的非常温暖的方法。的非常温暖的方法。 3去垢剂提取 无无去去垢垢剂剂detergentdetergent存存在在时时，膜膜结结合合酶酶大大部部分分存存在在于于离离心心后后的的沉沉淀淀里里，而而上上清清液液里里含含量量很很低低。去去垢垢剂剂可可以以将将膜膜结结合合酶酶溶溶解解下下来来。所所以以提提取取膜膜结结合合酶酶时时必必需需加加去去垢垢剂剂。离离子子型型去去垢垢剂剂的的反反响响性性比比非非离离子子型型的的强强，会会使使酶酶变变性性，所所以以在在提提取取膜膜结结合合酶酶时时用用非非离离子子型型去去

8、垢垢剂剂，常常用用的的是是曲曲拉拉通通。在在提提取取液液中中参参与与0.10.1的的Triton Triton x-100x-100可可将将膜膜结结合合酶洗脱下来。酶洗脱下来。 离子型去垢剂十二十二烷基硫酸基硫酸钠SDSSDS，阴离子型，阴离子型十六十六烷基溴化基溴化铵阳离子型阳离子型非离子型去垢非离子型去垢剂吐温吐温TweenTween曲拉通曲拉通TritonTriton十二十二烷基麦芽糖苷基麦芽糖苷n-dodecyl-D-altosiden-dodecyl-D-altoside，DMDMTween 20Triton X-1004浸透冲击 浸浸透透冲冲击osmotic osmotic sho

9、ckshock法法适适用用于于从从一一些些革革兰氏氏阴阴性性细菌菌提提取取酶。先先用用缓冲冲液液洗洗菌菌体体以以去去掉掉培培育育基基，接接着着把把菌菌体体重重新新悬浮浮在在含含2020蔗蔗糖糖的的缓冲冲液液中中，平平衡衡一一段段时间后后，离离心心分分别出出菌菌体体，这时细胞胞内内的的浸浸透透压很很高高。将将此此菌菌体体快快速速分分散散到到44的的水水中中，细胞胞迅迅速速吸吸水水会会引引起起某某些些细胞胞成成分分的的释放放，甚甚至至细胞胞破破裂裂。用用浸浸透透冲冲击法法从从大大肠杆杆菌菌中中提提取取卡卡那那霉霉素素乙乙酰转移移酶和和从从费氏氏发光光杆杆菌菌中中提提取取虫虫荧光光素素酶效效果果很很

10、好好。浸浸透透冲冲击法法不不适适用用于于革革兰氏氏阳阳性性细菌菌酶的的释放放，由由于于革革兰氏氏阳阳性性细菌菌的的细胞壁胞壁刚性很性很强。 2 2物理方法提取物理方法提取1超声波超声波2固体剪切固体剪切3液体剪切液体剪切4研磨或搅拌研磨或搅拌5忽然降压法忽然降压法1超声波 超超声声波波处处置置可可以以破破碎碎细细菌菌细细胞胞，但但也也有有些些细细菌菌如如链链球球菌菌对对超超声声破破碎碎有有很很强强的的抵抵抗抗力力。超超声声波波处处置置的的效效率率取取决决于于多多种种环环境境要要素素，除除处处置置时时间间外外，还还有有悬悬浮浮介介质质的的pHpH、温温度度和和离离子子强强度度。实实践践运运用用中

11、中根根本本上上是是靠靠阅阅历历来来选选定定处处置置条条件件，所所用用的的条条件件随着产物和细菌种类的不同而改动。随着产物和细菌种类的不同而改动。 超声波破碎只适用于小量细胞的破碎。超声波破碎只适用于小量细胞的破碎。 超声波破碎细胞的原理 超超声声波波作作用用于于液液领领会会产产生生一一种种称称为为空空穴穴作作用用的的景景象象，在在液液体体中中出出现现紧紧缩缩区区和和稀稀疏疏区区，稀稀疏疏区区中中构构成成的的空空穴穴在在稀稀疏疏区区转转变变成成紧紧缩缩区区时时，空空穴穴中中产产生生的的气气泡泡被被紧紧缩缩到到几几千千个个大大气气压压，紧紧接接着着气气泡泡崩崩解解构构成成冲冲击击波波。通通常常以以

12、为为此此冲冲击击波波是产生破坏力的主要要素。是产生破坏力的主要要素。 超超声声波波细细胞胞破破碎碎仪仪可可调调理理作作用用功功率率和和作作用用时间。时间。2固体剪切 将将菌菌体体和和磨磨料料硅硅藻藻土土混混合合，或或将将菌菌体体冷冷冻到到-20-20，冷冷冻生生成成的的冰冰晶晶作作为磨磨料料。把把它它们放放入入金金属属块上上的的圆孔孔内内，插插上上密密接接的的金金属属塞塞，向向塞塞顶施施加加150150230 230 MPaMPa的的压力力。此此法法能能使使特特定定的的悬浮浮液液中中的的细胞胞破破碎碎到到达达很很高高的的百百分分数数，但不能用于大但不能用于大规模地破碎。模地破碎。 固体剪切举例

13、 有有一一种种X X压榨榨机机，每每分分钟能能加加工工100100克克酿酒酒酵酵母母。这是是把把冷冷冻细胞胞从从一一个个多多孔孔圆盘挤出出而而使使细胞胞破破碎碎的的，孔孔出出口口处的的温温度度约为-22-22，细胞胞的的破破碎碎是是由由于于受受挤压的的细胞胞经过小小孔孔所所产生的剪切力呵斥的。生的剪切力呵斥的。 3液体剪切 液液体体剪剪切切与与固固体体剪剪切切原原理理类类似似。只只是是菌菌体体是是以以悬悬浮浮液液的的方方式式压压过过小小孔孔，小小孔孔的的孔孔径径更更小小，压力为压力为55 MPa55 MPa、 MPa MPa、275 MPa275 MPa等几种。等几种。 4研磨或搅拌 研研磨磨

14、或或搅拌拌用用的的磨磨料料为直直径径0.10.2 0.10.2 mmmm的的玻玻璃璃珠珠，将将玻玻璃璃珠珠和和细菌菌悬液液混混合合后后，高高速速振振荡或或剧烈烈搅拌拌，使使细胞胞破破碎碎。除除以以不不同同速速度度滚动的的玻玻璃璃珠珠之之间有有研研磨磨作作用用外外，细胞胞和和玻玻璃璃珠珠之之间还存存在在相相互互碰碰撞撞。细胞胞破破碎碎程程度度取取决决于于搅拌拌时间、搅拌拌速速度度、细胞胞浓度度、玻玻璃璃珠珠大大小小、玻玻璃璃珠珠的的量量等等。现已已证明明，根根据据这些些原原理理制制造造的的消消费安安装装是是破破碎碎某某些些“硬硬细胞胞的的最最有有效效的的方方法法，这些些“硬硬细胞胞包包括括变异异

15、链球球菌菌、溶血溶血链球菌、金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌。球菌、金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌。 5忽然降压法 将将细细胞胞悬悬浮浮液液装装进进高高压压容容器器，加加高高压压至至30Mpa30Mpa甚甚至至更更高高，翻翻开开出出口口阀阀门门，使使细细胞胞悬悬浮浮液液迅迅速速流流出出，出出口口处处的的压压力力忽忽然然降降低低到到常常压压，细胞迅速膨胀而破碎。细胞迅速膨胀而破碎。 爆炸式降压法 忽忽然然降降压压法法的的另另一一种种方方式式称称为为爆爆炸炸式式降降压压法法，它它是是将将细细胞胞悬悬浮浮液液装装入入高高压压容容器器，通通入入氮氮气气或或二二氧氧化化碳碳气气，加加压压至至5 550Mpa50M

16、pa，振振荡荡几几分分钟钟，使使气气体体分分散散到到细细胞胞内内，然然后后忽忽然然排排除除气气体体，压力骤降，使细胞破碎。压力骤降，使细胞破碎。 影响忽然降压法破碎效果的要素压压力力差差：普普通通压压力力差差要要到到达达3Mpa以以上上，才才有有较较好的破碎效果。好的破碎效果。压压力力降降低低速速度度：压压力力降降低低速速度度越越快快，破破碎碎效效果果越越好好，压压力力假假设设在在瞬瞬间间骤骤降降，可可以以到到达达爆爆炸炸性性效效果。果。细细胞胞的的种种类类和和生生长长期期：此此法法对对大大肠肠杆杆菌菌等等革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌的的破破碎碎效效果果较较佳佳，最最好好运运用用对对数数生生长长期

17、期的细胞。的细胞。 3 3提取液提取液1 1盐溶液盐溶液2 2酸溶液酸溶液3 3碱溶液碱溶液4 4有机溶剂有机溶剂1盐溶液 大大多多数数酶酶都都溶溶于于水水，在在低低盐盐浓浓度度条条件件下下，酶酶的的溶溶解解度度随随盐盐浓浓度度的的升升高高而而添添加加，这这称称为为盐盐溶溶景景象象。当当盐盐浓浓度度到到达达某某一一界界限限后后，酶酶的的溶溶解解度度随随着着盐盐浓浓度度的的升升高高而而降降低低，这这称称为为盐盐析析景景象象。所所以以普普通通采采用用稀稀盐盐溶溶液液提提取取酶酶，盐盐浓浓度度普普通通控控制制在在2020500mmol/L500mmol/L。 有有少少数数酶酶，如如霉霉菌菌脂脂肪肪酶

18、酶，用用不不含含盐盐的的清清水水提取效果较好。提取效果较好。 盐提取液举例 固固体体发发酵酵消消费费的的麸麸曲曲中中的的淀淀粉粉酶酶、蛋蛋白白酶酶等等胞胞外外酶酶，用用140mmol/L140mmol/L的的氯氯化化钠钠溶溶液液或或202050mmol/L50mmol/L的磷酸缓冲液提取。的磷酸缓冲液提取。 酵酵母母醇醇脱脱氢氢酶酶用用500mmol/L500mmol/L的的磷磷酸酸氢氢二二钠钠溶溶液液提取。提取。 6-6-磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶用用100mmol/L100mmol/L的的碳碳酸酸钠钠溶溶液提取。液提取。 枯枯草草杆杆菌菌碱碱性性磷磷酸酸酶酶用用100mmol/L10

19、0mmol/L的的氯氯化化镁镁溶溶液提取。液提取。2酸溶液 有有些些酶酶在在酸酸性性条条件件下下溶溶解解度度较较大大，且且稳稳定定性性较较好好，这这时时可可用用酸酸溶溶液液提提取取。酸酸浓浓度度也也不不能能太太高高，常常选选用用pH3pH36 6的的范范围围。如如胰胰蛋蛋白白酶酶可可以以用用0.12mol/L0.12mol/L的硫酸溶液提取。的硫酸溶液提取。 3碱溶液 有有些些酶酶在在碱碱性性条条件件下下溶溶解解度度较较大大，且且稳稳定定性性好好，这这时时可可用用碱碱溶溶液液提提取取。如如细细菌菌天天冬冬酰酰胺胺酶可用酶可用pH11pH1112.512.5的碱溶液提取。的碱溶液提取。 4有机溶

20、剂 有有些些与与脂脂质质结结合合结结实实或或含含有有较较多多非非极极性性基基团团的的酶酶，可可以以采采用用能能与与水水混混溶溶的的乙乙醇醇、丙丙醇醇、丁丁醇醇等等有有机机溶溶剂剂提提取取。如如琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶、胆胆碱碱脂脂酶酶、细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶等等，采采用用丁丁醇醇提提取取，效效果良好。果良好。 4 4影响酶提取的主要要素影响酶提取的主要要素1 1溶解度溶解度2 2温度温度3 3pHpH值值4 4提取液的体积提取液的体积5 5资料的破碎程度资料的破碎程度6 6搅拌搅拌1溶解度 一一种种物物质质在在某某一一种种溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度大大小小与与该该物物质质的的分分子子构

21、构造造及及所所运运用用的的溶溶剂剂的的理理化化性性质质有有亲亲密密关关系系。普普通通说说来来，极极性性物物质质在在极极性性溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度较较大大，非非极极性性物物质质那那么么在在非非极极性性溶溶剂剂中中溶溶解解度度较较大大。碱碱性性物物质质在在酸酸性性溶溶液液中中溶溶解解度较大，而酸性物质在碱性溶液中溶解度较大。度较大，而酸性物质在碱性溶液中溶解度较大。 2温度 普普通通说说来来，适适当当提提高高温温度度，可可以以提提高高酶酶的的溶溶解解度度，也也可可以以增增大大酶酶分分子子的的分分散散速速度度。但但温温度度过过高高容容易易引引起起酶酶的的变变性性失失活活。对对于于一一些些耐耐热

22、热的的酶酶，可可以以适适当当提提高高提提取取温温度度。但但要要留留意意蛋蛋白白酶酶对对目目的的酶酶的的破破坏坏作作用用，可可在在提提取取液液中中参参与与蛋蛋白酶抑制剂。白酶抑制剂。 在在等等电电点点条条件件下下，酶酶分分子子的的溶溶解解度度很很小小。不不同同的的酶酶分分子子等等电电点点不不同同，为为了了提提高高酶酶的的溶溶解解度度，应应防防止运用止运用pHpH与目的酶等电点相近的提取液。与目的酶等电点相近的提取液。 4 4提取液的体积提取液的体积 添添加加提提取取液液的的用用量量，可可以以提提高高酶酶的的提提取取率率，但但提提取取液液太太多多，会会使使酶酶的的浓浓度度降降低低，对对进进一一步步

23、分分别别纯纯化化不不利利。所所以以提提取取液液的的总总量量普普通通为为原原料料体体积积的的3 35 5倍，最好分几次提取。倍，最好分几次提取。3pH值5资料的破碎程度 含含酶酶原原料料破破碎碎后后的的颗颗粒粒越越小小，分分散散面面积积越越大大，有利于酶的提取。有利于酶的提取。 6 6搅拌搅拌 适适当当搅搅拌拌可可以以使使提提取取液液中中的的酶酶分分子子迅迅速速分分开开原原料料颗颗粒粒的的外外表表，从从而而增增大大两两相相界界面面的的浓浓度度差差，提高提取的效率。提高提取的效率。 二、分别纯化1沉淀法沉淀法7疏水层析疏水层析2透析与超滤透析与超滤8羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析3冰冻干燥冰冻干燥9

24、亲和层析亲和层析4液液液双水相抽提液双水相抽提10染料配基层析染料配基层析5凝胶层析凝胶层析11几种新型层析方法几种新型层析方法6离子交换层析离子交换层析12. 电泳电泳13结晶法结晶法 酶分别纯化的目的 酶酶的的分分别别纯纯化化是是把把目目的的酶酶与与其其它它杂杂质质别别分分开开，使使目目的的酶酶的的纯纯度度提提高高。酶酶的的纯纯度度用用比比活活性性来来衡衡量量。以以电电泳泳结结果果为为单单带带，且且进进一一步步纯纯化化不不能能提提高高比比活活性性为为到到达达均均一一。酶酶制制剂剂的的用用途途不不同同，对酶纯度的要求也不同。对酶纯度的要求也不同。 1 1沉淀法沉淀法 发发酵酵液液或或提提取取

25、液液的的体体积积普普通通很很大大，其其中中酶酶浓浓度度较较低低。为为了了纯纯化化操操作作方方便便，常常需需将将酶酶液液浓浓缩缩。纯纯化化过过程程中中有有时时也也需需求求将将酶酶液液浓浓缩缩。浓浓缩缩除能减少酶液体积外，还有一定的纯化作用。除能减少酶液体积外，还有一定的纯化作用。 1盐析法 不不同同的的蛋蛋白白质质在在不不同同的的盐盐浓浓度度下下溶溶解解性性不不同同，在在低低温温下下往往酶酶溶溶液液中中渐渐渐渐参参与与某某种种盐盐，在在不不同同的的盐盐浓浓度度下下有有不不同同的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀出出来来，离离心心可可获获得得不不同同的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀组组分分，这这叫叫分分级级沉沉淀淀。

26、常常用用的的盐盐是是硫硫酸酸铵铵，由由于于它它在在低低温温下下溶溶解解度度高高，对对大大多多数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。 盐析法的操作 在在低低温温下下往往酶酶液液中中渐渐渐渐参参与与硫硫酸酸铵铵粉粉末末并并搅搅拌拌，使使酶酶液液中中的的硫硫酸酸铵铵浓浓度度越越来来越越高高，不不同同的的蛋蛋白白质质在在不不同同的的硫硫酸酸铵铵浓浓度度下下沉沉淀淀出出来来。采采用用分分级级沉沉淀淀的的方方法法，既既能能沉沉淀淀出出目目的的酶酶，又又能能得得到到较较高高的的纯纯化化倍倍数数纯纯化化后后的的比比活活性性除除以以纯纯化化前前的的比比活活性为纯化倍数。性为

27、纯化倍数。 盐析法举例 从从大大肠肠杆杆菌菌菌菌株株W3310W3310提提取取青青霉霉素素酶酶是是一一个个典典型型的的例例子子。先先加加硫硫酸酸铵铵至至2020浓浓度度w/vw/v，这这时时酶酶尚尚未未沉沉淀淀，离离心心除除去去已已沉沉淀淀的的杂杂蛋蛋白白；再再加加硫硫酸酸铵铵至至5656浓浓度度w/vw/v，沉沉淀淀出出青青霉霉素素酶酶，酶酶纯纯化化了了5 5倍倍，同同时时使使体体积积6060升升的的样样品品缩缩减减到到重重2.4 2.4 kgkg的浆状沉淀物。的浆状沉淀物。 2有机溶剂沉淀 常常用用来来沉沉淀淀蛋蛋白白质质的的有有机机溶溶剂剂是是乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙酮酮。不不同同的的

28、蛋蛋白白质质在在不不同同的的有有机机溶溶剂剂浓浓度度下下沉沉淀淀出出来来。离离心心后后的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀尽尽快快除除去去有有机机溶溶剂剂，以以免酶在有机溶剂中时间太长而变性。免酶在有机溶剂中时间太长而变性。 3 3三氯乙酸沉淀三氯乙酸沉淀 离离心心后后的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀尽尽快快恢恢复复到到中中性性pHpH，以以免免酶在酸性环境下时间太长而变性。酶在酸性环境下时间太长而变性。4PEG沉淀 聚乙二醇对蛋白质有维护作用，用聚乙二醇对蛋白质有维护作用，用PEGPEG分级分级沉淀纯化效果很好。沉淀纯化效果很好。PEG2000PEG2000、40004000、60006000、80008000

29、都可以用。都可以用。 沉淀法要留意酶溶液的沉淀法要留意酶溶液的pHpH、离子强度、蛋、离子强度、蛋白质浓度、温度等条件。白质浓度、温度等条件。热处置沉淀杂蛋白 对对于于耐耐热热的的酶酶还还可可以以采采用用热热变变性性的的方方法法，高高温温下下短短时时间间处处置置，许许多多不不耐耐热热的的蛋蛋白白质质发发生生沉淀，离心后耐热的目的酶保管在上清液中。沉淀，离心后耐热的目的酶保管在上清液中。 2 2透析与超滤透析与超滤 透透析析是是将将酶酶液液装装在在半半透透膜膜做做成成的的口口袋袋里里，置置于于透透析析液液中中，酶酶液液中中的的小小分分子子物物质质可可以以透透过过半半透透膜膜进进入入到到透透析析液

30、液中中，而而大大分分子子的的酶酶不不能能透透过半透膜。过半透膜。 超超滤滤类类似似于于普普通通的的过过滤滤，只只是是滤滤孔孔很很小小，滤膜的性质以其截留分子量来衡量。滤膜的性质以其截留分子量来衡量。 1透析 将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液中，在低温下搅拌，改换几次透析液，可除去中，在低温下搅拌，改换几次透析液，可除去酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起到换缓冲液的作用。到换缓冲液的作用。 在装有酶液的透析袋外加固体在装有酶液的透析袋外加固体SephadexSephadex或或PEGPEG吸水，可浓缩酶液。吸水

31、，可浓缩酶液。2超滤 超超滤滤也也是是一一种种既既可可纯纯化化又又可可浓浓缩缩的的技技术术，它它是是利利用用不不同同孔孔径径的的超超滤滤膜膜，截截留留下下不不同同分分子子量量的的蛋蛋白白质质，从从而而使使分分子子量量不不同同的的蛋蛋白白质质别别分分开开，从从而而到到达达浓缩和纯化的目的。浓缩和纯化的目的。 超滤的方式有压滤、真空吸滤和离心超滤三种。超滤的方式有压滤、真空吸滤和离心超滤三种。微孔超滤膜 微微孔孔超超滤滤膜膜类类似似于于传传统统的的滤滤膜膜。膜膜是是刚刚性性的的，上上面面有有随随机机分分布布的的、平平均均大大小小为为5050500nm500nm的的孔孔。这这样样，小小分分子子会会经

32、经过过膜膜，而而大大分分子子那那么么会会被被膜膜挡挡住住。这这种种膜膜的的缺缺陷陷是是中中等等大大小小的的分分子子容易堵在孔中，使膜的通透才干逐渐下降。容易堵在孔中，使膜的通透才干逐渐下降。 各向异性分散膜 各各向向异异性性分分散散膜膜的的出出现，超超滤技技术获得得了了突突破破性性的的进展展，使使超超滤成成为大大规模模分分别和和纯化化酶的的一一种种有有用用技技术。各各向向异异性性膜膜是是由由一一种种高高度度加加固固的的很很薄薄的的“皮皮0.10.15m5m和和作作为支支持持物物的的支支撑撑在在下下面面的的较厚厚20m1mm20m1mm的的多多孔孔下下层构构造造组成成的的。由由于于活活性性层很很

33、薄薄，因因此此具具有有极极高高的的通通透透速速率率，而而支支持持物物的的多多孔孔性性又又使使得得任任何何经过膜膜的的分分子子不不被被支支持持物物所所阻阻留。留。 极化层 超超滤滤时时溶溶剂剂的的流流动动可可被被浓浓度度极极化化作作用用急急剧剧降降低低。这这是是由由于于在在膜膜外外表表构构成成一一层层排排阻阻的的溶溶质质，从从而而妨妨碍碍溶溶剂剂流流动动。由由此此层层呵呵斥斥的的对对溶溶剂剂流流动动的的阻阻抗抗会会逐逐渐渐增增高高，直直到到分分开开极极化化层层的的溶溶质质分分散散速速率率与与溶溶质质堆堆积积速速率率相相等等为为止止。超超滤滤安安装装设设计计的的目目的的是是使使极极化化层层坚坚持持

34、在在最最小小值值。实实验验室室的的安安装装是是采采用用搅搅拌拌方方式式添添加加溶溶质质从从极极化化层层分分开开的的速速率率来来到到达达的的。在在较较大大的的安安装装中中，采采用用高高速速经经过过中中空空通通道道的的方方式式来减少极化层的构成。来减少极化层的构成。 蛋白质的超滤特性 蛋蛋白白质质的的超超滤滤特特性性是是可可变变的的。WestmacottWestmacott19721972研研讨讨了了大大肠肠杆杆菌菌部部分分纯纯化化的的青青霉霉素素酶酶制制剂剂的的超超滤滤特特性性，他他运运用用一一种种截截留留分分子子量量30,00030,000的的各各向向异异性性膜膜，由由于于缓缓冲冲液液的的pH

35、pH和和盐盐浓浓度度不不同同，酶酶的的通通透透量量变变化化在在1.61.6到到5555之之间间；最最高高通通透透量量是是在在pH5.1pH5.16.26.2下下，接接近近酶酶的的等等电电点点；在在pH8.0pH8.0时时，把把缓缓冲冲液液的的浓浓度度从从1 1 mmol/Lmmol/L提提高高到到30 30 mmol/Lmmol/L，通通透透量量从从1.61.6添添加加到到2020；加加EDTAEDTA也也提提高高酶酶的的通通透透量量，而而尿尿素素有有相反的作用。相反的作用。 析滤 经经过过控控制制影影响响蛋蛋白白质质超超滤滤特特性性的的要要素素，可可使使纯纯化化倍倍数数得得到到明明显显的的提

36、提高高，例例如如大大肠肠杆杆菌菌青青霉霉素素酶酶的的纯纯度度可可提提高高7 7倍倍。超超滤滤也也可可用用于于快快速速去去除除大大量量的的低低分分子子量量溶溶质质，如如从从酶酶液液中中去去掉掉乙乙醇醇或脱盐，这种过程称为析滤。或脱盐，这种过程称为析滤。 3 3冰冻枯燥冰冻枯燥 在在一一密密闭闭容容器器中中对对结结冰冰的的酶酶液液抽抽真真空空，可可使使水水分分升升华华并并抽抽走走，到到达达浓浓缩缩或或枯枯燥燥的的目目的的。生生物物制制品品最最后后往往往往用用冰冰冻冻枯枯燥燥法法制制成成废废品品，便便于于储储存存和和运运输输。冰冰冻冻枯枯燥燥的的废废品品运运用用时时参参与与溶溶剂剂缓缓冲冲液液后后能

37、能迅迅速速溶溶解解。在在冰冰冻冻枯枯燥燥前前酶酶液液普普通通应应先先脱脱盐盐，否否那那么么会会因因构构成成低低共共熔熔混混合合物物，导导致致枯枯燥燥不完全、大量发泡和蛋白量变性。不完全、大量发泡和蛋白量变性。 4 4液液液双水相抽提液双水相抽提 以以往往通通常常用用离离心心或或过滤的的方方法法使使酶从从发酵酵液液或或菌菌体体匀匀浆液液中中分分别。但但在在中中试或或扩展展消消费时，或或因因要要求求相相当当大大容容量量的的高高速速冷冷冻离离心心机机离离心心力力10,000g10,000g，或或因因粘粘稠稠而而又又微微细的的物物质堵堵塞塞滤器器而而致致失失败。7070年年代代初初开开展展起起来来的的

38、液液液液双双水水相相抽抽提提技技术不不仅在在一一定定程程度度上上可可处理理此此棘棘手手问题，且且可可使使酶与与多多糖糖、核核酸酸等等可可溶溶性性杂质分分别，具具有有一一定的提定的提纯效果，有相当的适用价效果，有相当的适用价值。 液液双水相抽提的原理 抽抽提提在在制制药、化化工工等等行行业是是一一种种普普遍遍运运用用和和行行之之有有效效的的分分别提提纯技技术。这种种抽抽提提的的相相系系统多多系系有有机机溶溶剂组成成，由由于于大大多多数数酶在在有有机机溶溶剂中中不不仅溶溶解解性性能能差差，而而且且易易变性性失失活活，因因此此未未能能广广泛泛地地用用于于酶的的抽抽提提。早早在在18961896年年B

39、eijerinckBeijerinck就就发现了了亲水水性性聚聚合合物物hydrophi-lic hydrophi-lic polymerpolymer水水溶溶液液的的不不相相溶溶性性incompatibilityincompatibility，今今日日的的液液液液双双水水相相抽抽提提技技术即基于此。即基于此。 原理续 当当水水溶溶液液中中含含有有一一种种或或一一种种以以上上的的亲亲水水性性聚聚合合物物时时，假假设设聚聚合合物物的的浓浓度度到到达达一一定定的的阈阈值值以以上上，就就会会构构成成不不相相混混溶溶的的、可可分分别别的的两两相相，这这两两相相都都是是水水溶溶液液。亲亲水水性性聚聚合合

40、物物对对多多数数的的酶酶有有稳稳定定作作用用，因因此此为为酶酶提提供供了了一一个个易易溶溶而而又又不不易易破破坏坏的的抽抽提提环环境境。细细胞胞碎碎片片、多多糖糖、酯酯、核核酸酸以以及及酶酶的的性性质质不不同同，在在两两相相中中分分配配的的情情况况也也不不一一样样，在在多多数数情情况况下酶可与这些杂质迅速而有效地分别。下酶可与这些杂质迅速而有效地分别。 原理续 原原那那么么上上多多数数的的但但不不是是一一切切的的亲亲水水性性的的天天然然或或合合成成的的聚聚合合物物水水溶溶液液在在一一定定的的条条件件下下相相混混均均可可构构成成分分别别的的双双水水相相，如如聚聚乙乙二二醇醇polyethylen

41、e polyethylene glycolglycol与与右右旋旋糖糖酐酐dextrandextran，或或聚聚乙乙二二醇醇与与磷磷酸酸钾钾盐盐水水溶溶液液相相混混时时均均可可构构成成分分别别的的双双水水相相。相相的的组组成成及及其其构构成成分分别别相相时聚合物的浓度间的关系可用相图表示。时聚合物的浓度间的关系可用相图表示。 双水相的相图相图的阐明 液液液液双双水水相相抽抽提提的的相相图是是一一条条双双曲曲线，在在双双曲曲线的的上上方方溶溶液液可可构构成成分分别的的两两相相，在在下下方方那那么么为均均相相。T T点点对应的的坐坐标表表示示上上相相的的组成成，B B点点对应的的坐坐标表表示示下下

42、相相的的组成成。T1T1、T2T2、T3 T3 及及B1B1、B2B2、B3 B3 称称为节点点，衔接接节点点的的直直线称称为节线，在在同同一一节线上上任任何何一一点点的的上上相相及下相的及下相的组成一成一样，但相体，但相体积是不同的。是不同的。 相图的阐明 C C为为临临界界点点，在在C C点点上上相相和和下下相相的的组组成成和和体体积积都都一一样样，参参与与极极少少量量的的水水即即可可导导致致分分别别的的两两相相转转变变成成均均相相。当当体体系系的的总总组组成成为为P P点点时时，体体系系分分为为两两相相，上上相相组组成成为为T1T1，下下相相组组成成为为B1B1。当当P P点点在在T1B

43、1T1B1节节线线上上挪挪动动时时，上上下下两两相相的的组组成成不变，但二者的体积发生变化。不变，但二者的体积发生变化。 影响相图的要素 相相图图是是选选择择构构成成分分别别两两相相时时所所含含多多聚聚物物或或盐盐的的量量的的根根据据。有有些些相相图图可可从从资资料料中中查查得得，也也可可经经过过实实验验获获得得所所需需的的相相图图。除除多多聚聚物物或或盐盐的的浓浓度度可可影影响响双双相相的的构构成成外外，多多聚聚物物的的分分子子量量、温温度度、放放置置时时间间及及体体系系中中存存在在的的低低分分子子物物质质等等均可影响双相的构成。均可影响双相的构成。 各种双水相系统组分组分聚丙二醇聚丙二醇甲

44、甲基基聚聚丙丙二二醇醇、聚聚乙乙二二醇醇、聚聚乙乙烯烯醇醇、聚聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基葡聚糖、右旋糖酐乙烯吡咯烷酮、羟丙基葡聚糖、右旋糖酐聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇、右旋糖酐、聚蔗糖聚乙烯醇、右旋糖酐、聚蔗糖甲基纤维素甲基纤维素羟甲基葡聚糖、右旋糖酐羟甲基葡聚糖、右旋糖酐乙基羟乙基纤维素乙基羟乙基纤维素 右旋糖酐右旋糖酐羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖右旋糖酐右旋糖酐聚蔗糖聚蔗糖右旋糖酐右旋糖酐聚乙二醇聚乙二醇硫硫酸酸镁镁、硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠、甲甲酸酸钠钠、酒酒石石酸钾钠酸钾钠酶在两相中的分配系数 单单位位体体积积上上相相中中酶酶的的活活性性与与单单位位体体积积下下相相中中酶酶的的活活性性之之比比

45、K K称称为为分分配配系系数数：K= K= CTCTCBCB，式式中中CTCT为为单单位位体体积积上上相相中中酶酶的的活活性性，CBCB为为单单位位体体积积下下相相中中酶酶的的活活性性。多多聚聚物物或或磷磷酸酸盐盐的的量量、pHpH值值、离离子子强强度度及及被被抽抽提提物物的的量量均均可可影影响响分分配配系系数数。蛋蛋白白质质的的分分配配系系数数通通常常在在0.10.11010之之间间。分分配配系系数数的的大大小小及及上上下下相相体体积积之之比比与与分分别别效效果果有有关关，分分配配系系数数远远大大于于1 1且且上上相相体体积积较较大大时时分分别别效效果果较较好好，收收率率较较高。高。 收率的

46、计算公式YT为上相收率，为上相收率，YB为下相收率，为下相收率，VT和和VB分分别为上、下相的体积，别为上、下相的体积，K为分配系数。为分配系数。双水相抽提的运用特点 常常用用的的液液液液双双水水相相抽抽提提系系统有有两两种种类型型。第第一一类相相系系统由由聚聚乙乙二二醇醇和和右右旋旋糖糖酐组成成，构构成成两两相相后后上上相相为聚聚乙乙二二醇醇富富相相PEG-rich PEG-rich phasephase，下下相相为右右旋旋糖糖酐富富相相dextran-rich dextran-rich phasephase。第第二二类相相系系统由由聚聚乙乙二二醇醇和和盐常常用用的的为磷磷酸酸钾或或硫硫酸酸

47、铵组成成，上上相相仍仍为聚聚乙乙二二醇醇富富相相，下下相相为盐富富相相。无无论哪哪种种类型型，各各相相均均含含有有7070以以上上的水分，故的水分，故为酶的溶解与抽提提供了适宜的的溶解与抽提提供了适宜的环境。境。 双水相抽提的运用特点 所所需需设备比比较简单，仅需需一一个个可可使使粗粗提提液液与与两两相相系系统充充分分混混合合及及放放置置的的贮罐罐和和低低速速离离心心机机或或使使两两相迅速分相迅速分别的分的分别器。器。 操操作作方方便便，条条件件温温暖暖。在在液液液液双双水水相相抽抽提提中中，由由于于聚聚乙乙二二醇醇、右右旋旋糖糖酐这类多多聚聚物物可可作作为酶活活性性的的稳定定剂，即即使使在在

48、常常温温下下操操作作酶活活性性也也不不易易损失失。假假设相相系系统选择适适宜宜，收收率率普普通通可可在在80809090。此此法法不不仅能能使使酶和和细胞胞碎碎片片、多多糖糖、酯、核核酸酸等等杂质迅迅速速分分开开，而而且且有有一一定定的的提提纯效效果果，提提纯倍倍数数可可为2 22020倍。倍。双水相延续抽提 液液液液双双水水相相抽抽提提技技术在在开开场时仅用用于于粗粗提提液液的的处置置，现已已开开展展到到用用于于后后处置置工工艺的的精精制制阶段段，即即经几几次次延延续的的液液液液双双水水相相抽抽提提使使产品品获得得相相当当高高的的纯度度。如如由由保保依依地地尼尼假假丝酵酵母母发酵酵产生生的的

49、甲甲酸酸脱脱氢酶经四四次次延延续抽抽提提得得到到总收收率率为7070，纯度度大大于于7070的的产品品。此此产品品的的质量量符符合合NADHNADH辅酶再再生生酶膜膜反反响响器器用用酶的的需需求求，同同时由由于于工工艺简单，原原资料料本本钱低低，产品品价价钱大大幅幅度度地地降降低。低。 5 5凝胶层析凝胶层析凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析 凝凝胶胶层析析的的原原理理可可以以用用3-3-氯-1,2-1,2-环氧氧丙丙烷交交联的的SephadexSephadex凝凝胶胶交交联葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶来来阐明明。所所用用的的葡葡聚聚糖糖也也称称为右右旋旋糖糖酐是是由由肠膜膜

50、明明串串珠珠菌菌产生生的的产物物，葡葡萄萄糖糖残残基基主主要要以以-1,6-1,6-糖糖苷苷键衔接接。交交联程程度度受受所所用用的的3-3-氯-1,2-1,2-环氧氧丙丙烷含含量量控控制制，从从而而决决议了了凝凝胶胶基基质的的水水合合复复得得水水程程度度及及凝凝胶胶的的孔孔隙隙度度。每每单位位干干重重凝凝胶胶复复得得的的水水越越多多，其其孔孔隙隙度度也也越越大大，它它所所能能分分级分分别的的分分子子也也越越大大。葡葡聚聚糖糖交交联剂之比越大，孔隙度也越大，反之孔隙度小。之比越大，孔隙度也越大，反之孔隙度小。 凝胶层析原理 假假设设将将一一混混合合物物上上样样到到柱柱的的上上端端，洗洗脱脱时时，

51、大大分分子子量量的的分分子子因因不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部的的孔孔隙隙而而最最先先流流出出，而而小小分分子子量量的的分分子子因因能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，延延伸伸了了行行进进的的道道路路而而后后流流出出。不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部的的最最小小分分子子的的分分子子量量称称为为该该凝凝胶胶的的排排阻阻限限制制。在在能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部的的分分子子当当中中，分分子子量量较较大大的的先先流流出出，分分子子量量较较小小的的后后流流出出，这这样样就就能能将将不不同同分分子子量量大大小小的的物物质质分分开开。将将洗洗脱脱液液分分部部搜搜集集，找找出出酶

52、酶活活性峰所在的管，即可得到纯化的酶。性峰所在的管，即可得到纯化的酶。 凝胶层析的原理分分子子太太大大，都都不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒，大大小小不不等等的的分分子子最最早早同时流出。同时流出。分分子子太太小小，都都能能进进入入到到凝凝胶胶颗颗粒粒的的最最小小孔孔中中，大大小小不不等等的的分分子子最最晚同时流出。晚同时流出。有有效效分分别别范范围围，按按分分子子从从大大到到小小依次流出。依次流出。排阻限制排阻限制凝胶层析柱的再生用洗脱液不断洗即可使柱再生。用洗脱液不断洗即可使柱再生。 交联葡聚糖柱层析洗脱曲线凝胶层析的分配系数 凝凝胶胶层层析析过过程程是是溶溶质质分分子子在在流流动动的的溶

53、溶剂剂相相和和多多孔孔胶胶粒粒构构成成的的固固定定相相的的内内部部孔孔隙隙间间进进展展分分散散分分配配的的过过程程。分分配配系系数数KavKav可可简简单单地地从从以以下下公公式式得得出：出： Kav Kav(Ve(VeVo)/(VtVo)/(VtVo)Vo) 式式中中VeVe从从柱柱上上洗洗脱脱下下溶溶质质需需溶溶剂剂的的体体积积，VoVo外水体积，外水体积，VtVt柱床的总体积。柱床的总体积。 利用凝胶层析测定蛋白质的分子量 阅阅历历阐阐明明，KavKav值值与与分分子子量量的的对对数数成成反反比比。凝凝胶胶层层析析除除可可用用于于分分别别分分子子量量不不同同的的蛋蛋白白质质分分子子外外，

54、还还可可用用来来测测定定蛋蛋白白质质分分子子的的分分子子量量。先先用用假假设设干干种种知知分分子子量量的的蛋蛋白白质质分分别别测测出出其其KavKav值值，以以分分子子量量的的对对数数为为纵纵坐坐标标，以以KavKav值值或或简简单单地地以以洗洗脱脱体体积积为为横横坐坐标标，作作出出规规范范曲曲线线，再再测测出出未未知知分分子子量量蛋蛋白白质质的的KavKav值值或或洗洗脱脱体体积积，在在曲曲线上可查出其分子量的对数。线上可查出其分子量的对数。 凝胶层析介质的型号 SephadexSephadex有有不不同同的的型型号号，如如Sephadex Sephadex G-100G-100，Sepha

55、dex Sephadex G-25G-25等等。SephacrylSephacryl是是交交联联的的烯烯丙丙基基葡葡聚聚糖糖和和N,NN,N甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺共共聚聚物物，如如Sephacryl Sephacryl S-100, S-100, S-200, S-200, S-300, S-300, S-400, S-400, S-S-500, 500, S-1000S-1000等等，后后面面的的数数字字越越大大那那么么孔孔隙隙度度越越大。大。 凝胶层析介质的型号 近近年年来来，除除了了上上述述SephadexSephadex和和SephacrylSephacryl外外，还有有多多种种

56、资料料用用作作凝凝胶胶层析析的的基基质，如如聚聚丙丙烯酰胺胺Bio Bio Gel Gel P P系系列列、琼脂脂糖糖Sepharose Sepharose 2B2B，4B4B，6B6B和和Bio Bio Gel Gel A A系系列列、交交联琼脂脂糖糖Sepharose Sepharose CL-2BCL-2B，CL-4BCL-4B，CL-6BCL-6B、高高度度交交联琼脂脂糖糖Superose Superose 6 6，1212、交交联琼脂脂糖糖和和葡葡聚聚糖糖Superdex Superdex 3030，7575，200200、聚聚苯苯乙乙烯、琼脂脂糖糖聚聚丙丙烯酰胺胺混混合合物物、多多

57、孔孔玻玻璃璃和和聚聚甲甲基基丙丙烯酸酸甲甲酯等等。普普通通是是后后面面的的数数字字越越大大孔孔隙隙度度越越大，但大，但SepharoseSepharose相反。相反。SephadexSephadex的型号和特性的型号和特性型号型号干颗粒直径干颗粒直径（m）干胶吸水量干胶吸水量（ml/g）干胶溶胀度干胶溶胀度（ml/g）蛋白质分离范围蛋白质分离范围 G1040120 1.00.123 700G25粗粗中中细细超超细 100 30050 15020 8010 402.50.2461kD5kDG50粗粗中中细细超细超细 1003005015020801040 5.00.39111.5kD30kDG1

58、00超细超细 40 12010 40101.515204kD150kD4kD100kDG200超细超细 40 12010 40202.030405kD600kD5kD250kDSepharose的型号与特性的型号与特性型号型号琼脂糖含琼脂糖含量（量（%） 湿颗粒直径湿颗粒直径（m）蛋白蛋白质分离范围分离范围 2B2206070kD40000kD4B4146060kD20000kD6B645165 10kD4000kD6 6离子交换层析离子交换层析 离离子子交交换剂分分为阳阳离离子子交交换剂和和阴阴离离子子交交换剂两两类，阳阳离离子子交交换剂的的衬质上上带有有阳阳离离子子交交换基基团，常常见的的

59、阳阳离离子子交交换基基团有有-SO3H-SO3H、-COOH-COOH、- -CH2COOH(CM)CH2COOH(CM)等等；阴阴离离子子交交换剂的的衬质上上带有有阴阴离离子子交交换基基团，常常见的的阴阴离离子子交交换基基团有有-NH3-NH3Cl Cl 、二乙基胺乙基、二乙基胺乙基DEAEDEAE等。等。 离子交换层析分别蛋白质的原理 蛋蛋白白质质分分子子上上具具有有各各种种阴阴阳阳离离子子基基团团，在在一一定定的的pHpH和和离离子子强强度度下下，这这些些基基团团可可与与离离子子交交换换剂剂上上的的相相应应基基团团进进展展离离子子交交换换，使使蛋蛋白白质质分分子子吸吸附附到到离离子子交交

60、换换剂剂上上。改改动动pHpH和和或或离离子子强强度度又又可可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。将这些吸附的蛋白质洗脱下来。离子交换层析分别蛋白质的原理 在在一一定定的的上上样样和和洗洗脱脱条条件件下下，不不同同蛋蛋白白质质分分子子所所带带的的净净电电荷荷和和电电荷荷密密度度不不同同，分分子子大大小小也也不不同同，它它们们与与离离子子交交换换剂剂的的结结合合力力不不同同，结结合合力力较较弱弱的的先先洗洗脱脱eluteelute下下来来，结结合合力力较较强强的的后后洗洗脱脱下下来来，从从而到达分别的目的。而到达分别的目的。 洗洗脱脱的的方方式式有有单单一一溶溶液液洗洗脱脱、阶阶段段洗洗脱脱和和梯梯度度

61、洗洗脱脱等等。洗洗脱脱时时可可改改动动洗洗脱脱液液的的pHpH，也也可可改改动动洗洗脱脱液的离子强度，甚至二者同时改动。液的离子强度，甚至二者同时改动。 蛋白质的离子交换性质 在在普普通通情情况况下下，碱碱性性蛋蛋白白质质等等电电点点大大于于pH7.0pH7.0在在pHpH小小于于等等电电点点时时带带正正电电荷荷，被被阳阳离离子子交交换换剂剂吸吸附附；酸酸性性蛋蛋白白质质等等电电点点小小于于pH7.0pH7.0在在pHpH大大于于等等电电点点时时带带负负电电荷荷，被被阴阴离离子交换剂吸附。子交换剂吸附。 离子交换层析普通在偏中性条件下上样。离子交换层析普通在偏中性条件下上样。离子交换剂衬质的种

62、类 离离子子交交换换剂剂的的衬衬质质也也称称载载体体常常见见的的有有树树脂脂、纤纤维维素素cellulosecellulose、葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶SephadexSephadex、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶SepharoseSepharose、丙丙烯烯酸共聚物酸共聚物TrisacrylTrisacryl等。等。 离子交换树脂 离离子子交交换换树树脂脂物物理理性性能能稳稳定定，蛋蛋白白质质吸吸附附容容量量高高，装装柱柱时时沉沉降降迅迅速速，洗洗脱脱时时允允许许高高流流速速，但但它它的的高高吸吸附附力力在在用用于于蛋蛋白白质质纯纯化化时时却却往往往往是是缺缺陷陷，由由于于蛋蛋白白质质能能够够经经受受不

63、不住住从从树树脂脂上上洗洗脱脱下下来来所所必必需需的的猛猛烈烈条条件件，所所以以不不常常用用于于蛋蛋白白质质的纯化。的纯化。 离子交换纤维素 离离子子交交换换纤纤维维素素价价钱钱较较廉廉，交交换换容容量量较较低低，普普通通为为离离子子交交换换树树脂脂交交换换容容量量的的非非常常之之一一，洗洗脱条件温暖，是常用的离子交换剂。脱条件温暖，是常用的离子交换剂。 离子交换Sephadex 离离子子交交换换SephadexSephadex凝凝胶胶是是在在Sephadex Sephadex G-G-2525或或Sephadex Sephadex G-50G-50上上引引入入DEAEDEAE或或CMCM基基

64、团团制制备备成的。成的。 以以Sephadex Sephadex G-50G-50为为衬衬质质的的离离子子交交换换凝凝胶胶具具有有高高蛋蛋白白容容量量，但但它它们们较较软软，而而且且在在缓缓冲冲液液pHpH或或离离子子强强度度改改动动时时会会收收缩缩或或膨膨胀胀，不不宜宜用用于于柱层析。柱层析。 离子交换Sepharose和Trisacryl 把把DEAEDEAE或或CMCM基基团团引引入入交交联联琼琼脂脂糖糖或或丙丙烯烯酸酸共共聚聚物物可可得得到到离离子子交交换换SepharoseSepharose和和TrisacrylTrisacryl。这这两两种种类类型型的的离离子子交交换换剂剂是是由由

65、小小而而均均匀匀的的、能能确确保保高高流流速速的的珠珠形形颗颗粒粒组组成成，具具有有高高蛋蛋白白容容量量。它它们们在在普普通通层层析析压压力力下下不不变变形形，更更重重要要的的是是它它们们在在离离子子强强度度改改动动时时及及极极端端pHpH下下都都不不会会收收缩缩或或膨膨胀胀，因因此此可可在在柱柱中中再再生，在大规模操作时这是很主要的优点。生，在大规模操作时这是很主要的优点。 离子交换剂的再生阳离子交阳离子交换剂：0.5N HCl0.5N NaOH0.5N HCl水水平衡平衡阴离子交阴离子交换剂：0.5N NaOH0.5N HCl0.5N NaOH水水平衡平衡“批式离子交换 离离子子交交换剂除

66、除用用于于柱柱层析析外外，还可可用用于于“批批式式batchbatch方方法法。它它是是把把离离子子交交换剂加加到到具具有有一一定定离离子子强度度和和pHpH的的大大体体积酶液液中中，使使酶交交换到到离离子子交交换剂上上，把把吸吸附附了了酶的的离离子子交交换剂与与溶溶液液分分开开，再再将将离离子子交交换剂放放入入小小体体积洗洗脱脱液液中中洗洗脱脱。这样不不仅能能使使酶得得到到一一定定的的纯化化，还可到达可到达浓缩的目的。的目的。 “批式法的优缺陷 批批式式方方法法操操作作简简便便，但但普普通通来来说说，批批式式方方法法比比柱柱层层析析纯纯化化效效果果差差，但但对对某某些些等等电电点点离离中中性

67、性很很远远的的酶酶来来说说，采采用用批批式式方方法法也也能能得得到到较较好好的的纯纯化化效效果果。如如用用CM-CM-纤纤维维素素批批式式法法可可将将等等电电点点为为pH8.6pH8.6的的L-L-天冬酰胺酶纯化天冬酰胺酶纯化100100倍。倍。 7 7疏水层析疏水层析 ShaltielShaltiel等等人人在在19721972年年发发现现溴溴化化氰氰活活化化的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶被被碳碳链链长长短短不不同同的的烃烃类类衍衍生生物物取取代代后后，可可选选择择性性地地吸吸附附某某些些酶酶。进进一一步步的的研研讨讨阐阐明明，这这种种选选择择性性的的吸吸附附作作用用是是琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶介介质

68、质与酶之间的疏水力作用的结果。与酶之间的疏水力作用的结果。 疏水层析的原理 酶酶分分子子的的外外表表既既有有亲亲水水性性的的基基团团或或区区域域，也也有有非非极极性性的的疏疏水水基基团团( (如如亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸) )或或区区域域。疏疏水水基基团团或或区区域域可可在在酶酶分分子子的的外外表表，也也可可处处于于亲亲水水区区域域包包围围之之中中，构构成成疏疏水水性性的的小小孔孔或或袋袋。在在一一定定的的条条件件下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶上上的的疏疏水水基基团团可可以以和和酶酶分分子子外外表表或或孔孔袋袋中中的的疏疏水水基基团团发发陌陌生生水水相相互互作

69、作用用，使使酶酶分分子子吸吸附附到到凝凝胶胶上上。用用能能减减弱弱疏疏水水相相互互作作用用的的洗洗脱脱液液洗洗脱脱，就就能能把把疏疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。 疏水层析介质 目目前前常常用用的的三三种种疏疏水水层层析析介介质质是是Butyl-Butyl-Sepharose Sepharose CL-4BCL-4B、Phenyl-Sepharose Phenyl-Sepharose CL-4BCL-4B和和Octyl-Sepharose Octyl-Sepharose CL-4BCL-4B。 三三 者者 中中 ， Butyl-Butyl-Seph

70、arose Sepharose CL-4BCL-4B的的疏疏水水作作用用力力最最弱弱，Octyl-Octyl-Sepharose Sepharose CL-4BCL-4B的的疏疏水水作作用用力力最最强强。普普通通在在不不了了解解目目的的酶酶的的疏疏水水性性能能时时，先先试试用用疏疏水水作作用用力力较较小的介质。小的介质。 影响疏水作用的要素 疏疏水水作作用用对对于于温温度度的的影影响响是是非非常常敏敏感感的的，温温度度高高时时疏疏水水作作用用力力添添加加，反反之之那那么么减减少少。溶溶质质的的性性质质也也可可影影响响疏疏水水作作用用力力，引引起起盐盐析析作作用用的的物物质质如如NaClNaCl

71、、Na2SO4Na2SO4等等可可添添加加疏疏水水作作用用力力，而而引引起起盐盐溶溶作作用用的的物物质质如如盐盐酸酸胍胍、硫硫氰氰化化钾钾、氯化四乙铵、尿素等那么使疏水作用力减少。氯化四乙铵、尿素等那么使疏水作用力减少。 不同离子对疏水相互作用的影响盐析效析效应加加强 盐溶效溶效应加加强 NH4 ， Rb ， K ， Na ， Cs ， Li ， Mg2 ， Ca2 ， Ba2 PO43，SO42，CH3COO，Cl ，Br，NO3，ClO4，I ，SCN 阳离子阳离子阴离子阴离子疏水层析的上样和洗脱条件 酶酶液液在在高高盐盐浓浓度度如如含含有有1 13 3 molmolL L (NH4)2

72、(NH4)2 SO4SO4的的缓缓冲冲液液时时上上样样，然然后后用用降降低低盐盐浓浓度度的的缓缓冲冲液液、水水或或非非极极性性溶溶剂剂如如乙乙二二醇醇等等洗洗脱。脱。 用尿素或乙醇、丁醇洗即可再生。用尿素或乙醇、丁醇洗即可再生。 疏水层析介质的再生疏水层析的优点 疏水层析有三个优点：疏水层析有三个优点：a. a. 由由于于在在高高盐盐浓浓度度时时吸吸附附，硫硫酸酸铵铵沉沉淀淀后后的的样样品不用脱盐可直接上样；品不用脱盐可直接上样；b. b. 洗脱条件温暖，酶活回收率高；洗脱条件温暖，酶活回收率高；c. c. 洗洗脱脱液液盐盐浓浓度度低低，便便于于和和后后续续纯纯化化步步骤骤相相衔衔接。接。 8

73、 8 羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析 羟羟基基磷磷灰灰石石hydroxyapatite, hydroxyapatite, HAHA是是一一种种白白色色颗颗粒粒，分分子子式式为为 Ca10(PO4)6(OH)2Ca10(PO4)6(OH)2，它它能能非非特特异异性性地地吸吸附附蛋蛋白白质质。羟羟基基磷磷灰灰石石分分别别大大分分子子的的机机理理还还不不完完全全清清楚楚，普普通通以以为为HAHA结结晶晶外外表表外外露露的的Ca2+ Ca2+ 和和PO43- PO43- 参参与与大大分分子子的的分分级级分分别别。 酸酸性性和和中中性性蛋蛋白白质质与与HAHA上上的的Ca2+ Ca2+ 位位点点结结合合，

74、高高浓浓度度NaClNaCl、KClKCl、或或CaCl2CaCl2的的存存在在既既不不影影响响两两者者的的结结合合，也也不不影影响响洗洗脱脱。碱碱性性蛋蛋白白质质是是结结合合在在HAHA的的PO43- PO43- 基基团团上上，NaClNaCl、KClKCl、和和CaCl2CaCl2的存在会剧烈影响吸附和洗脱。的存在会剧烈影响吸附和洗脱。羟基磷灰石层析的上样与洗脱条件 不不同同的的蛋蛋白白质质洗洗脱脱所所需需的的条条件件不不同同。普普通通将将酶酶液液在在低低浓浓度度磷磷酸酸缓缓冲冲液液条条件件下下上上样样，用用逐逐渐渐添添加加磷磷酸酸盐盐浓浓度度的的阶阶段段洗洗脱脱或或浓浓度度梯梯度度洗洗脱

75、脱，从从而而使使各各种种蛋蛋白白质质分分别别。酸酸性性和和中中性性蛋蛋白白质质的的洗洗脱脱普普通通是是用用pHpH约约6.86.8的的低低浓浓度度磷磷酸酸缓缓冲冲液液3030120 120 mmol/Lmmol/L。碱碱性性蛋蛋白白质质普普通通用用中中浓浓度度的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液120120230 230 mmol/Lmmol/L进进展展洗洗脱脱，但但也也有有一一些些碱性蛋白质用浓度很高的碱性蛋白质用浓度很高的CaCl2CaCl2也洗不下来。也洗不下来。羟基磷灰石柱层析洗脱曲线羟基磷灰石层析效果举例 用用HAHA柱柱层析析进展展酶的的大大规模模分分别纯化化可可得得到到良良好好的的效效果果。

76、用用1616升升的的HAHA柱柱，从从上上样的的脂脂肪肪嗜嗜热芽芽孢杆杆菌菌抽抽提提出出的的500g500g蛋蛋白白质中中胜利利地地分分别出出了了6 6种种酶。此此外外，从从20kg20kg大大肠杆杆菌菌EM20031EM20031所所得得的的蛋蛋氨氨酰-tRNA-tRNA合合成成酶3.61063.6106单位位也也在在HAHA柱柱上上进展了分展了分级分分别，产率率为8585，纯度提高了度提高了1212倍。倍。前述方法的总结 前前述述分分别别方方法法都都是是利利用用不不同同蛋蛋白白质质分分子子的的理理化化性性质质不不同同而而将将它它们们分分别别的的。对对每每一一种种方方法法来来说说，都都有有许

77、许多多其其它它分分子子因因其其在在该该方方面面的的理理化化性性质质与与目目的的酶酶相相近近而而无无法法分分开开，但但多多种种方方法法结结合运用，可得到较纯的产品。合运用，可得到较纯的产品。9亲和层析亲和层析1原理原理2载体衬质载体衬质 3配基配基4手臂手臂5偶联方法偶联方法亲和层析的原理 亲亲和和层层析析是是利利用用蛋蛋白白质质分分子子的的生生物物特特异异性性进进展展分分别别，因因不不同同分分子子的的生生物物特特异异性性差差别别较较大大，所所以以分分别别效效率率高高。酶酶与与底底物物、酶酶与与辅辅酶酶、酶酶与与抑抑制制剂剂、激激素素与与受受体体、抗抗原原与与抗抗体体之之间间都都有有特特异异的的

78、结结合合才才干干，将将一一方方称称其其为为配配基基偶偶联联到到载载体体上上，即可特异性地与对应的另一方结合。即可特异性地与对应的另一方结合。 亲和层析的过程 亲亲和和层层析析的的设设计计原原理理和和过过程程可可大大致致分分为为三三步步。一一是是选选择择适适宜宜的的配配基基与与不不溶溶性性的的载载体体偶偶联联，构构成成具具有有特特异异亲亲和和性性的的分分别别介介质质；二二是是在在适适当当的的条条件件下下，亲亲和和介介质质选选择择性性地地吸吸附附酶酶或或其其它它生生物物活活性性分分子子，杂杂质质与与介介质质间间没没有有亲亲和和作作用用，故故不不能能吸吸附附而而被被洗洗涤涤去去除除；三三是是选选择择

79、适适当当的的条条件件使使被被吸吸附附在在亲亲和介质上的酶或其它生物活性分子洗脱下柱。和介质上的酶或其它生物活性分子洗脱下柱。 载体载体应具有以下根本特性：载体应具有以下根本特性： a. 与蛋白质的反响弱，以防止非专注性吸附。与蛋白质的反响弱，以防止非专注性吸附。 b. 偶联上配基后应具有良好的溶剂流速。偶联上配基后应具有良好的溶剂流速。 c. 含含有有可可修修饰饰的的化化学学基基团团，偶偶联联上上配配基基后后载载体体的的构构造不受破坏。造不受破坏。 d. 可可修修饰饰的的化化学学基基团团含含量量丰丰富富，偶偶联联后后具具有有高高吸吸附容量。附容量。 e. 在在偶偶联联和和洗洗脱脱的的各各种种条

80、条件件下下，机机械械和和化化学学性性质质稳稳定。定。 f. 具具有有疏疏松松的的孔孔和和亲亲水水的的网网络络构构造造，可可使使大大分分子子自自在经过，最好是球形、大小均匀、刚性的。在经过，最好是球形、大小均匀、刚性的。 琼脂糖和交联琼脂糖凝胶载体 珠珠粒粒状状的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶SepharoseSepharose是是在在亲亲和和层层析析中中运运用用最最广广的的载载体体。交交联联琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶Sepharose Sepharose CL-4BCL-4B较较其其母母体体有有更更佳佳的的理理化化稳稳定定性性，假假设设在在运运用用时时需需求求更更为为猛猛烈烈的的条条件件，可可思思索索选选用

81、用交交联联琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶作作为为载载体体。但但是是，交交联联会会导导致致供供偶偶联联配配基基的的位位点点减减少少，吸吸附附容容量量也也会会相相应应减减少。少。 配基 配基配基选择能否适宜是关系到能否适宜是关系到亲和和层析成析成败的决的决议要素。可以作要素。可以作为配基的物配基的物质很多，可很多，可为较小的有机分子，也可小的有机分子，也可为天然的生物活性分子。天然的生物活性分子。根据配基的性根据配基的性质，可将其分，可将其分为两大两大类： 特异配基特异配基 通用配基通用配基特异配基 普普通通说说来来，酶酶和和专专注注性性抑抑制制剂剂、抗抗原原和和抗抗体体、激激素素和和受受体体中中的的一一方

82、方均均为为特特异异配配基基。以以此此类类配配基基构构成成的的亲亲和和层层析析介介质质的的选选择择特特异异性性最最高高，分分别别效效果果也也最最好好。缺缺陷陷是是此此类类配配基基多多系系不不稳稳定定的的生生物物活活性性物物质质，在在偶偶联联时时活活性性损损失失大大，价价钱钱昂昂贵贵，本本钱钱高。高。 special ligand通用配基 以以此此类类配配基基制制备备的的亲亲和和层层析析介介质质可可用用于于一一类类物物质质的的分分别别。如如用用NADHNADH作作配配基基可可以以吸吸附附脱脱氢氢酶酶类类，用用ATPATP作作配配基基可可以以吸吸附附激激酶酶类类，用用外外源源凝凝集集素素一一类类特特

83、殊殊的的蛋蛋白白质质，可可与与某某些些细细胞胞外外表表的的特特定定糖糖蛋蛋白白结结合合，使使细细胞胞凝凝集集作作配配基基可可以以吸吸附附糖糖蛋蛋白白类类。用用通通用用配配基基制制成成的的亲亲和和层层析析介介质质的的选选择择性性低低于于用用特特异异配配基基制制成成的的亲亲和和层层析析介介质质，但但前前者者的的运运用用范范围围较较广广，其其中中不不少少已已有有商商品品供供应应，故故运运用用方方便便，价价钱钱也也略略较较后者廉价。后者廉价。 general ligand亲和层析中常用的配基被分离物质被分离物质可用作配基的物质可用作配基的物质酶酶底物、底物类似物、抑制剂、辅助因子底物、底物类似物、抑制

84、剂、辅助因子抗体抗体抗原、病毒、细胞抗原、病毒、细胞凝集素凝集素多糖、糖蛋白、细胞表面受体多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸核酸互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白核酸结合蛋白激素、维生素激素、维生素 受体、载体蛋白受体、载体蛋白细胞细胞细胞表面专一蛋白、凝集素细胞表面专一蛋白、凝集素配基与酶的亲和力 理理想想的的配配基基在在溶溶液液中中与与酶酶结结合合后后的的解解离离常常数数应应为为10-810-810-4 10-4 mol mol /L/L。当当解解离离常常数数大大于于10-4 10-4 mol mol /L/L时时亲亲和和性性太太低低，不不能能

85、有有效效地地吸吸附附酶酶，如如酶酶与与某某些些弱弱抑抑制制剂剂之之间间的的亲亲和和性性即即属属此此情情况况。反反之之，当当解解离离常常数数低低于于10-8 10-8 mol mol /L/L时时亲亲和和性性太太强强，导导致致洗洗脱脱非非常常困难，如激素与受体间的亲和性即属这种情况。困难，如激素与受体间的亲和性即属这种情况。 另另外外，配配基基的的构构造造中中应应有有多多个个功功能能基基团团，以以保保证在与载体偶联后不影响它和酶特异性结合的部位。证在与载体偶联后不影响它和酶特异性结合的部位。 手臂(或称连杆) 用用小小分分子子配配基基直直接接偶偶联联到到载载体体上上制制备备亲亲和和层层析析介介质

86、质时时，虽虽然然配配基基和和酶酶之之间间的的亲亲和和力力在在适适当当的的范范围围内内，但但其其吸吸附附容容量量往往往往很很低低。这这是是由由于于酶酶的的活活性性中中心心经经常常深深陷陷在在内内部部，由由于于载载体体的的空空间间妨妨碍碍影影响响，配配基基与与酶酶的的活活性性中中心心无无法法接接近近。为为改改动动这这种种情情况况，可可在在载载体体与与配配基基之之间间插插入入一一个个手手臂臂一一段段链链状状构构造造以以消消除除空空间间妨妨碍碍，此此手手臂臂不不可可太太短短也也不不可可太太长长，太太短短不不能能起起到到消消除除空空间间妨妨碍碍的的作作用用，太长那么往往使非特异性的作用如疏水作用添加。太

87、长那么往往使非特异性的作用如疏水作用添加。 偶联方法 最最常常用用的的偶偶联联方方法法是是溴溴化化氰氰法法。在在碱碱性性条条件件下下使使溴溴化化氰氰与与多多糖糖载载体体上上的的两两个个相相邻邻羟羟基基反反响响，产产生生少少量量不不活活泼泼的的氨氨基基甲甲酸酸衍衍生生物物和和大大量量活活化化的的亚亚氨氨碳碳酸酸酯酯衍衍生生物物，亚亚氨氨碳碳酸酸酯酯基基团团再再与与被被偶偶联联分分子子上上的的氨氨基基反反响响，产产生生三三种种结结合合产产物物，其其中中异异脲脲型型为为主主要要产物。产物。 溴溴化化氰氰是是剧剧毒毒物物质质，实实验验室室操操作作时时要要特特别别小小心心。现已有溴化氰活化的现已有溴化氰

88、活化的Sepharose CL-4BSepharose CL-4B供应。供应。溴化氰活化法的反响式活泼型活泼型不活泼型不活泼型溴化氰活化后与酶的偶联主要产物主要产物洗 脱非非专一性洗脱专一性洗脱改变温度洗脱改变温度洗脱改变改变pH洗脱洗脱改变离子强度洗脱改变离子强度洗脱改变溶剂系统洗脱改变溶剂系统洗脱加促溶剂洗脱加促溶剂洗脱电泳解吸电泳解吸专一性洗脱专一性洗脱半抗原竞争性洗脱半抗原竞争性洗脱抑制剂竞争性洗脱抑制剂竞争性洗脱底物类似物竞争性洗脱底物类似物竞争性洗脱1010染料配基层析染料配基层析 自自2020世世纪纪7070年年代代起起，人人们们陆陆续续发发现现单单氯氯、二二氯氯三三嗪嗪类类活活

89、性性染染料料如如Cibacron Cibacron Blue Blue F3G-AF3G-A可可以以和和一一系系列列生生物物活活性性物物质质起起作作用用，此此作作用用类类似似于于生生物物活活性性物物质质与与其其天天然然配配基基间间的的作作用用。实实践践上上这这些些染染料料与与生生物物活活性性物物质质之之间间并并不不存存在在任任何何生生物物学学关关系系，因因此此称称它它们们为为假假配配基基pseudo-ligandpseudo-ligand或或染染料料配配基基dye-liganddye-ligand，由由此此开开展展起起来来的的层层析析技技术术称称为为 假假 亲亲 和和 层层 析析 pseudo

90、 pseudo affinity affinity chromatographychromatography或或染染料料配配基基层层析析dye-ligand dye-ligand chromatographychromatography。 染料配基层析的优点a. 作作为为配配基基的的染染料料是是化化学学合合成成的的，来来源源方方便便，价价钱也廉价。钱也廉价。b. 由由于于染染料料构构造造中中有有活活性性氯氯存存在在，故故载载体体不不需需活活化即可直接与染料配基偶联，操作较简单。化即可直接与染料配基偶联，操作较简单。c. 染染料料配配基基层层析析介介质质与与生生物物活活性性物物质质间间的的结结合

91、合力力较强，吸附容量较大。较强，吸附容量较大。d. 分别效果较好，收率普通也较高。分别效果较好，收率普通也较高。染料配基层析的运用范围 由由于于染染料料配配基基层层析析有有上上述述优优点点，开开展展非非常常迅迅速速。运运用用染染料料配配基基层层析析可可提提纯纯脱脱氢氢酶酶类类、水水解解酶酶类类、乙乙酰酰基基转转移移酶酶类类、激激酶酶类类、磷磷酸酸核核糖糖转转移移酶酶类类、转转氨氨酶酶类类、磷磷酸酸化化酶酶类类、磷磷酸酸二二酯酯酶酶类类、脱脱羧羧酶酶类类、合合成成酶酶类类及及人人血血洁洁白白蛋蛋白白、血血凝凝因因子子、血清脂蛋白等，可见它的运用是非常广泛的。血清脂蛋白等，可见它的运用是非常广泛的

92、。 染料配基层析的运用范围 由由于于染染料料配配基基层层析析有有较较好好的的分分别别效效果果，运运用用该该技技术术纯纯化化的的最最终终产产品品的的质质量量可可望望符符合合各各方方面面的的要要求求，特特别别是是医医药药和和基基因因操操作作技技术术的的要要求求。因因此此，染染料料配配基基层层析析是是一一种种新新型型的的、有有广广泛泛用用途途的的分分别别提提纯纯技技术术。目目前前市市场场上上有有多多种种规规格格的的染染料料配配基基层层析介质供应。析介质供应。 染料配基的种类 染染料料配配基基的的化化学学构构造造和和性性质质不不仅仅关关系系到到它它与与载载体体偶偶联联的的才才干干，而而且且还还直直接接

93、影影响响它它与与生生物物活活性性物物质质的的作作用用。常常用用的的染染料料配配基基有有以以Cibacron Cibacron Blue Blue F3G-F3G-A A为为代代表表的的蒽蒽醌醌类类活活性性染染料料及及以以Procion Procion Red Red H3-BH3-B为为代代表表的的萘萘类类活活性性染染料料。这这两两类类染染料料中中均均有有三三嗪嗪环环的的构构造造，环环上上的的氯氯非非常常活活泼泼，可可非非常常容容易易地地与与载载体体上上的的羟羟基基或或氨氨基基发发生生亲亲核核反反响响，因因此此染染料料配配基基与与载载体的偶联反响是在非常温暖的碱性条件下进展的。体的偶联反响是在

94、非常温暖的碱性条件下进展的。 Cibacron Blue F3G-A构造式Procion Red H2-B构造式酶与染料配基之间的作用 当当酶酶或或其其它它生生物物活活性性物物质质被被染染料料配配基基层层析析介介质吸附时，它们之间的作用能够有三种情况：质吸附时，它们之间的作用能够有三种情况：a. a. 完全是特异性的亲和作用；完全是特异性的亲和作用；b. b. 特异性的作用与非特异性的作用如静电吸特异性的作用与非特异性的作用如静电吸 引、离子交换等综协作用的结果；引、离子交换等综协作用的结果；c. c. 完全是非特异性的作用。完全是非特异性的作用。 酶与染料配基之间的作用 Cibacron C

95、ibacron Blue Blue F3G-AF3G-A对对于于大大多多数数与与NADNAD和和NADPNADP有有关关的的脱脱氢氢酶酶类类及及与与ATPATP有有关关的的激激酶酶类类的的特特异异性性结结协协作作用用是是染染料料配配基基层层析析中中的的一一种种特特殊殊景景象象。染染料料构构造造中中的的蒽蒽醌醌部部分分被被以以为为是是某某些些生生物物活活性性物物质质相相应应的的核核苷苷酸酸部部分分的的竞竞争争性性抑抑制制剂剂，即即类类似于腺嘌呤部位的构造。似于腺嘌呤部位的构造。 染料配基层析的条件 酶酶吸吸附附和和洗洗脱脱的的条条件件与与缓缓冲冲液液的的种种类类、离离子子强强度度、pHpH、金金

96、属属离离子子、特特异异配配基基等等有有关关，应应经经过过实实验验找找出出最最正正确确的的吸吸附附和和洗洗脱脱条条件件，以以获获得最高的纯化倍数和收率。得最高的纯化倍数和收率。 染料配基层析的本卷须知a. PH 在在运运用用染染料料配配基基层析析时，系系统中中的的pH极极为重重要要，由由于于染染料料配配基基与与酶之之间除除特特异异性性的的亲和和作作用用外外，还有有非非特特异异性性的的离离子子交交换作作用用。在在pH低低于于大大多多数数酶的的等等电点点时，非非特特异异性性的的吸吸附附添添加加。如如在在pH5.0时96的的血血浆蛋蛋白白被被Blue A凝凝胶胶吸吸附附，而而在在pH9.0时仅白白蛋蛋

97、白白和和脂脂蛋蛋白白被被吸吸附附。有有时降降低低pH可可添添加加染染料料酶复复合合物物的的结合合力力和和稳定定性性，有有时降降低低pH可可使使洗洗脱脱解解析析加加快快。实践践运运用用中中应根根据据详细情情况况选择适宜的适宜的pH。 pH对鼠肌肉丙酮酸激酶与Procion Red HE3B-Sepharose结合力的影响pH 6.06.57.07.58.0每毫升凝胶结合每毫升凝胶结合丙酮酸激酶的活性丙酮酸激酶的活性（u） 44.223.119.76.7 0.4 染料配基层析的本卷须知b. 金金属属离离子子 少少量量的的二二价价阳阳离离子子，尤尤其其是是Mg2+，可可明明显显地地影影响响染染料料配

98、配基基与与某某些些酶酶的的结结合合力力。运运用用Matrex gel Red A 柱柱层层析析纯纯化化兔兔肌肌丙丙酮酮酸酸激激酶酶、酵酵母母己己糖糖激激酶酶、磷磷酸酸甘甘油油激激酶酶或或兔兔肌肌激激酶酶时时，假假设设缓缓冲冲液液中中含含有有10mmol/L MgCl2，除除兔兔肌肌激激酶酶外外其其它它三三种种酶酶与与介介质质间间的的结结合合力力明明显显添添加加。其其它它的的二二价价阳阳离离子子如如Ca2+、Mn2+ 等等及及某某些些一一价价阳阳离离子子如如K+、Na+ 等等也也有有类类似似的的作作用用。故故可可用用金金属属离离子子调调理理和和改改动动染染料料配配基基层层析析的的选选择择性性。在

99、在洗洗脱脱时时假假设设由由于于金金属属离离子子的的存存在在而而吸吸附附过过强强时时，可可在在洗洗脱脱液液中中参参与与低低浓浓度度的的EDTA消除此影响。消除此影响。 染料配基层析的本卷须知c. 洗洗脱脱条条件件 可可用用含含适适当当浓浓度度氯氯化化钠钠、氯氯化化钾钾、氯氯化化钙钙、氯氯化化铵铵、硫硫酸酸铵铵、甘甘油油、乙乙二二醇醇、尿尿素素、硫硫氰氰酸酸钠钠或或Triton X-100的的缓缓冲冲液液进进展展非非特特异异性性的的洗洗脱脱，也也可可用用含含有有底底物物、辅辅酶酶，或或另另外外一一些些特特异异性性的的可可溶溶性性配配基基如如NAD(P)+、NAD(P)H、ATP、ADP、CoA、F

100、MN、Blue A、Red A等等作作特特异异性性的的洗洗脱脱。特特异异性性洗洗脱脱可可使使染染料料配配基基层层析析的的分分别别效效果进一步提高。果进一步提高。 柱层析安装图11. 几种新型层析方法 径径向向流流动动层层析析法法为为上上世世纪纪8080年年代代后后期期才才开开展展起起来来的一种新的色谱分别技术。径向流动层析法的特点是：的一种新的色谱分别技术。径向流动层析法的特点是： 1. 1. 可可以以在在低低线线性性流流速速下下更更大大流流量量操操作作，较较传传统统层层析法提高流速析法提高流速5 l55 l5倍，提高效率。倍，提高效率。 2. 2. 柱压低。柱压低。 3. 3. 广广泛泛适适

101、用用于于离离子子交交换换、亲亲和和、疏疏水水等等多多种种层层析析介质。介质。 4. 4. 便便于于线线性性放放大大，不不仅仅可可用用于于实实验验室室的的研研讨讨，放放大中试并可用于大规模的消费分别和纯化。大中试并可用于大规模的消费分别和纯化。 缺陷是分辨率略低。缺陷是分辨率略低。A. 径向流动层析径向流动层析Radial Flow Chromatography径向流动层析柱样品和流样品和流动相进口动相进口流动相流动相出口出口层析介质层析介质多孔管壁多孔管壁Sepragen公司专利的径向公司专利的径向柱，商品名为柱，商品名为Superflo柱柱B. 灌注层析 传传统统的的凝凝胶胶层层析析存存在在

102、凝凝胶胶孔孔内内流流动动相相停停滞滞区区域域产产生生的的传传质质阻阻力力，分分别别度度低低。虽虽然然经经过过减减小小介介质质粒粒度度和和改改良良介介质质制制备备方方法法可可减减小小这这种种影影响响，但但无无法法完完全全消消除除。灌灌注注层层析析就就是是采采用用大大孔孔介介质质，在在高高流流速速下下产产生生溶溶质质随随流动相穿透介质粒子的传质方式的新型层析技术。流动相穿透介质粒子的传质方式的新型层析技术。 在在研研制制用用于于过过滤滤或或作作为为催催化化剂剂载载体体的的大大孔孔聚聚合合物物颗颗粒粒孔孔径径到到达达1001000nm1001000nm时时发发现现，当当膜膜的的孔孔径径到到达达500

103、nm500nm时时，只只需需两两边边有有微微小小的的压压力力差差，便便可可引引发发孔孔内内的的对对流流传传质质。假假设设在在层层析析介介质质颗颗粒粒上上有有这这种种贯贯穿穿粒粒子子的的特特大大的的对对流流传传质质孔孔，被被分分别别的的溶溶质质便便会会随随流流动动相相一一同同迅迅速速流流过过介介质质的的大大孔孔，而而不不是是靠靠浓浓度度梯梯度度进进展展分分散散传质，因此能加快传质过程。传质，因此能加快传质过程。 Perfusion Chromatography 灌注层析介质 美美国国Perseptive Perseptive BiosystemsBiosystems公公司司开开发的的POROSP

104、OROS系系列列灌灌注注色色谱填填料料是是由由苯苯乙乙烯和和二二乙乙烯苯苯经过悬浮浮聚聚合合、乳乳液液聚聚合合等等方方式式制制备的的多多孔孔型型高高分分子子微微球球，其其颗粒粒内内部部分分布布着着两两种种构构造造的的孔孔隙隙。一一种种是是贯穿穿整整个个颗粒粒的的特特大大孔孔，孔孔径径在在600800nm600800nm之之间，称称为穿穿透透孔孔或或对流流孔孔；另另一一种种是是衔接接这些些特特大大孔孔的的较小小一一些些的的大大孔孔，孔孔径径为500150nm500150nm，孔孔深深普普通通不不超超越越1m1m，被被称称为衔接接孔孔或或分散孔。分散孔。 虽然然在在穿穿透透孔孔之之间还存存在在假假

105、设干干分分散散孔孔，它它们不不能能构构成成快快速速对流流传质，但但这种种孔孔的的深深度度普普通通不不超超越越1m1m，分分散散程程很很短短，不不会会呵呵斥斥明明显的的传质阻阻力力，而而且且分散孔的存在恰恰提供了分散孔的存在恰恰提供了较大的外表大的外表积和柱容量。和柱容量。 灌注层析的特点 灌灌注注色色谱谱法法利利用用流流动动相相和和溶溶质质的的对对流流作作用用，降降低低了了溶溶质质在在介介质质内内滞滞留留的的限限制制，明明显显地地缩缩短短了了蛋蛋白白质质的的分分别别时时间间，无无论论是是分分析析色色谱谱还还是是制制备备色色谱谱，进进展展时时得得到到的的蛋蛋白白质质质质量量、产产量量和和产产率率

106、都都有有所所提提高高。根根据据这这种种色色谱谱的的特特殊殊构构造造，在在高高流流速速下下也也不不会会因因传传质质较较慢慢而而使使谱带展宽。谱带展宽。 介介质质中中随随着着衔衔接接的的官官能能团团不不同同，可可分分为为反反相相R R型型、强强阴阴离离子子交交换换Q Q型型和和强强阳阳离离子子交交换换S S型型等等多多种种介介质质类类型。型。 穿透孔穿透孔分散孔分散孔C. 膜层析 膜膜层层析析以以多多孔孔膜膜作作为为基基质质资资料料，膜膜上上偶偶联联配配基基，利利用用配配基基与与蛋蛋白白质质等等目目的的分分子子之之间间的的相相互互结结协协作作用用进进展展分分别别纯纯化化。当当样样品品以以一一定定流

107、流速速流流过过膜膜时时，目目的的分分子子与与膜膜介介质质外外表表或或膜膜孔孔内内基基团团特特异异性性结结合合，而而杂杂质质那那么么透透过过膜膜孔孔流流出出，上上样样后后再再经经过过洗洗脱脱液液将将目目的的分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍。分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍。轴向膜层析轴向膜层析径向膜层析径向膜层析膜层析的特点 膜膜层层析析中中的的每每一一片片膜膜都都相相当当于于一一个个短短而而粗粗的的吸吸附附床床层层，膜膜厚厚相相当当于于床床层层高高度度，当当床床层层体体积积一一定定时时，这这种种构构造造有有利利于于在在一一样样压压降降下下获获得得更更高高的的流流速速，从从而

108、提高分别速度和处置量。而提高分别速度和处置量。 膜膜层层析析易易于于放放大大，便便于于实实现现大大规规模模延延续续分分别别和和自动操作。自动操作。 根根据据膜膜上上偶偶联联基基团团的的不不同同，膜膜层层析析可可分分为为亲亲和和膜层析、疏水膜层析、离子交换膜层析等类型。膜层析、疏水膜层析、离子交换膜层析等类型。 多级膜层析 为了获得更高的纯化效果，近年来还出现了多为了获得更高的纯化效果，近年来还出现了多级膜层析，即将不同类型的膜介质组合在一同构成级膜层析，即将不同类型的膜介质组合在一同构成新的层析柱进展分别。这里的技术关键是根据目的新的层析柱进展分别。这里的技术关键是根据目的产物选择适当的膜介质

109、陈列顺序和缓冲液条件，以产物选择适当的膜介质陈列顺序和缓冲液条件，以便使上一层洗脱下来的目的蛋白可以被下一层吸附。便使上一层洗脱下来的目的蛋白可以被下一层吸附。假设安排合理，多级膜层析可以大大缩短混合产品假设安排合理，多级膜层析可以大大缩短混合产品的分别时间，提高分别效率。的分别时间，提高分别效率。 1212电泳电泳凝胶电泳凝胶电泳等电聚焦等电聚焦双向电泳双向电泳 凝胶电泳 有支持物，如淀粉、聚丙烯酰胺凝胶、琼有支持物，如淀粉、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂等。用于分析、小量纯化和纯脂糖凝胶、琼脂等。用于分析、小量纯化和纯度鉴定。度鉴定。SDS-PAGESDS-PAGESDS-polyacr

110、ylamide gel SDS-polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis还可以用来测定蛋白质的分还可以用来测定蛋白质的分子量。子量。 有有SDSSDS，无，无SDSSDS，均匀胶，梯度胶。，均匀胶，梯度胶。等电聚焦 在在凝凝胶胶中中加加两两性性电电解解质质ampholineampholine，也也叫叫ampholyteampholyte，普普通通为为pH3.5pH3.51010。如如今今开开展展出出了了immobiline drystripimmobiline drystrip。 双向电泳 第第 一一 向向 等等 电电 聚聚 焦焦 ，

111、第第 二二 向向 SDS-PAGESDS-PAGE或或Native-PAGENative-PAGE。可分辨出。可分辨出50005000多个点。多个点。 按按电电泳泳槽槽分分，有有圆圆盘盘电电泳泳，垂垂直直板板电电泳泳，程度槽电泳，制备电泳，毛细管电泳等。程度槽电泳，制备电泳，毛细管电泳等。 对对电电泳泳结结果果可可用用电电脑脑软软件件分分析析，既既可可定定性性又可定量。又可定量。1313结晶法结晶法 把把酶酶提提纯纯到到一一定定纯纯度度后后通通常常以以为为应应到到达达50%50%以以上上，可可以以使使其其结结晶晶。虽虽然然结结晶晶的的酶酶不不一一定定能能成成为为均均一一的的证证据据，但但伴伴随

112、随结结晶晶的的构构成成，酶酶的的纯纯度度经经常常有有一一定定程程度度的的提提高高。从从上上述述意意义义讲讲，酶酶的的结结晶晶既既是是酶酶提提纯纯的的结结果果，也也是是纯纯化化酶酶的的手手段段。此此外外，为为研研讨讨蛋蛋白白质质空空间间构构造造提提供供x x射射线线衍衍射射样样品，也是酶结晶的重要目的之一。品，也是酶结晶的重要目的之一。 蛋白质结晶的原理 蛋蛋白白质质分分子子多多数数处处于于含含水水的的环环境境中中，蛋蛋白白质质分分子子与与水水分分子子结结合合构构成成稳稳定定的的水水合合物物。当当蛋蛋白白质质的的浓浓度度非非常常高高的的时时候候，溶溶液液中中就就没没有有足足够够的的水水可可以以与

113、与蛋蛋白白质质构构成成水水合合物物，在在蛋蛋白白质质分分子子之之间间也也没没有有足足够够的的水水分分子子可可以以把把它它们们充充分分隔隔开开，于于是是蛋蛋白白质质就就以以无无定定形形沉沉淀淀或或结结晶晶的的方方式式从从溶溶液中析出。液中析出。 蛋白质结晶的原理 构构成成无无定定形形沉沉淀淀的的缘缘由由在在于于部部分分能能量量降降到到最最低低，致致使使分分子子凝凝聚聚过过程程发发生生过过快快之之故故。当当然然在在能能障障不不大大的的情情况况下下，从从无无定定形形沉沉淀淀可可以以渐渐渐渐长长成成晶晶体体。普普通通来来讲讲，该该当当非非常常小小心心而而缓缓慢慢地地使使蛋蛋白白质质溶溶液液到到达达过过

114、饱饱和和点点，此此时时蛋蛋白白质质分分子子不不能能被被充充分分水水合合，但但蛋蛋白白质质分分子子有有充充分分的的时时机机将将其其本本身身有有序序地陈列到晶格中，从而构成称心的蛋白质结晶。地陈列到晶格中，从而构成称心的蛋白质结晶。 影响蛋白质溶解度的要素 许许多多能能引引起起蛋蛋白白质质溶溶解解度度改改动动的的方方法法都都可可用用于于酶酶的的结结晶晶。知知蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度受受电电解解质质的的性性质质和和浓浓度度、pHpH及及温温度度等等要要素素的的广广泛泛影影响响。作作为为结结晶晶的条件，这些环境要素都应予以充分思索。的条件，这些环境要素都应予以充分思索。 有机溶剂结晶法 有有些些有

115、有机机溶溶剂能能引引起起蛋蛋白白质构构成成结晶晶，常常用用的的有有机机溶溶剂有有甲甲醇醇、乙乙醇醇、异异丙丙醇醇、丁丁醇醇、丙丙酮、乙乙腈、2-2-甲甲基基2,4-2,4-戊戊二二醇醇、1,3-1,3-丙丙二二醇醇、2,5-2,5-已已二二醇醇、-丁丁内内酯、二二甲甲亚砜、二噁、二噁烷等。等。有机溶剂结晶法 结晶原理可以从以下两个方面了解：晶原理可以从以下两个方面了解：当当有有机机溶溶剂加加到到蛋蛋白白质水水溶溶液液中中以以后后，与与水水结合合，从从蛋蛋白白质分分子子周周围“夺走走大大量量水水分分子子，这样就就大大大大降降低低了了这个个系系统充充分分溶溶解解这些些大大分分子子的的才才干。干。当

116、当把把有有机机溶溶剂加加到到蛋蛋白白质的的水水溶溶液液中中之之后后，明明显降降低低了了溶溶剂的的介介电常常数数，致致使使蛋蛋白白质分分子子失失去去了了赖以以维持溶液持溶液稳定性的静定性的静电维护层。 盐析法 盐盐析析法法广广泛泛运运用用于于酶酶的的结结晶晶。其其原原理理是是在在适适当当pHpH、温温度度等等条条件件下下，坚坚持持酶酶的的稳稳定定，缓缓慢慢改改动动盐盐浓浓度度，使使酶酶溶溶液液到到达达过过饱饱和和点点，析析出出结结晶晶。盐盐析析法法结结晶晶时时运运用用的的盐盐有有硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠、乙乙酸酸铵铵、硫硫酸酸镁镁、氯氯化化钙钙、硝硝酸酸铵铵、甲甲酸酸钠钠等等。其中最常用的是硫

117、酸铵。其中最常用的是硫酸铵。 盐析法 利利用用硫硫酸酸铵盐析析法法进展展结晶晶时，可可以以采采用用两两种种方方法法，一一是是将将硫硫酸酸铵或或其其浓溶溶液液加加到到酶液液中中，至至酶液液微微呈呈浑浊，然然后后在在低低温温下下放放置置，析析出出酶结晶晶。另另一一种种方方法法是是采采用用抽抽提提的的方方法法，先先将将酶蛋蛋白白用用100%100%饱和和度度的的硫硫酸酸铵溶溶液液沉沉淀淀下下来来，再再在在00用用逐逐渐降降低低浓度度的的硫硫酸酸铵溶溶液液抽抽提提，然然后后在在44冰冰箱箱和和77室室温温中中交交替替放放置置结晶晶。这是是利利用用酶蛋蛋白白在在同同一一硫硫酸酸铵饱和和度度下下，在在低低

118、温温时酶蛋蛋白白的的溶溶解解度度高高，逐逐渐升升高高温温度度时酶蛋白溶解度降低的性蛋白溶解度降低的性质，使之析出，使之析出结晶。晶。14. 提纯方法的选择和顺序 价价钱钱本本钱钱低低廉廉的的先先用用，效效率率高高的的先先用用，利利用用不不同同的的性性质质差差别别尽尽量量不不反反复复利利用用同同一一性性质质，稀稀释释的的步步骤骤和和浓浓缩缩的的步步骤骤交交替替进进展展，留留意对样品中盐浓度的浓稀要求，减少脱盐步骤。意对样品中盐浓度的浓稀要求，减少脱盐步骤。 酶纯化过程的效果步步 骤骤总酶活性总酶活性(u)总蛋白质总蛋白质(mg)收率收率(%)比活性比活性(u/mg protein)纯化倍数纯化倍

119、数粗酶液粗酶液895335593100161PEG5-13%沉淀沉淀6689683974.7805Sephadex G-10052626104.658.850331Hydroxyapatite4083118.645.62195137Phenyl-Sepharose218250.92524.4235951475FPLC MonoQ63110.0547.01168707300伤诱导番茄果实伤诱导番茄果实4kgACC合成酶的纯化步骤和结果合成酶的纯化步骤和结果纯度规范 电泳单带，柱层析单峰，电泳单带，柱层析单峰，N-N-末端和末端和C-C-末端氨末端氨基酸检测单一，继续纯化比活性不添加。要有三基酸检测单一，继续纯化比活性不添加。要有三种以上方法证明均一才干以为是均一。种以上方法证明均一才干以为是均一。 用于不同的研讨需求不同纯度的酶制剂，不用于不同的研讨需求不同纯度的酶制剂，不都要求均一。都要求均一。酶储存中的稳定性 枯枯燥燥的的酶在在44下下很很稳定定。酶溶溶液液中中可可加加甘甘油油、DTTDTT、BSABSA等等维护剂。有有最最适适保保管管pHpH与与最最适适反反响响pHpH可可以以不不同同。蛋蛋白白质浓度度大大较稳定。防止反复定。防止反复冻融。融。