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1、硕士论文-基于结构生物学的金属蛋白酶抑制剂类抗癌药物的发现与活性研究 ,分类号: 单位代码:学 号:密级:厶蒌另孥博士学位论文论文题目:基于结构生物学的金属蛋白酶抑制剂类抗癌药物的发现与活性研究: 冯金红作者姓名业专 药物化学指导教师姓名徐文方教授专业技术职务年月日原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。日期:迦釜:丝论文作者签名:曼金关于学位论文使用授权的声明本人完全
2、了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定论文作者签名:丝金坐导师签名:差象叁荔日 期:【:兰丝夕:季博士学位论文录目摘 要?.符号说明?。第一章 前言第一节金属蛋白酶与恶性肿瘤.金属蛋白酶?.金属蛋白酶与恶性肿瘤.第二节组蛋白去乙酰化酶.组蛋白去乙酰化酶家族.组蛋白去乙酰化酶晶体结构?.组蛋白去乙酰化酶的主要生物学功能.组蛋白去乙酰化酶抑制剂?.第三节氨肽
3、酶.氨肽酶家族?.氨肽酶抑制剂.第四节基于结构生物学的合理药物设计.结构生物学?.基于结构的药物设计?.确定靶点活性位点.基于分子对接的虚拟筛选.从头设计?第二章人和古菌属硫化叶菌的克隆,表达,纯化,蛋白晶体筛选以及酶理化性质研究.只季博士学位论文第节人的克隆,表达,纯化与晶体筛选.实验材料.菌株、基因组与载体质粒.试剂配置?.主要试剂与工具酶?.主要仪器?.实验方法.基因克隆.重组蛋白的表达及条件优化.重组蛋白的分离纯化?.蛋白晶体筛选与优化?.?.实验结果?.重组蛋白质的诱导表达?.一一重组质粒表达的的分离与纯化.重组质粒表达的的分离与纯化?.的蛋白晶体?。第二节人的生化活性研究?。.实验
4、材料.试剂?一.主要仪器?实验方法。.荧光分析法测定活性并计算比活力?.一氧化氮供体,.的合成及对活性的影响?. 法检测发生.亚硝基化修饰的.实验结果.原核重组表达的人具有酶活性.一氧化氮供体,及对活性的影响?.只鬈博士学位论文.人能够发生.亚硝基化修饰?第三节古茵属硫化叶菌的克隆、表达、纯化与晶体筛选.实验材料.菌株、基因组与载体质粒.试剂配置?.主要试剂与工具酶.主要仪器?.实验方法.基因克隆?.重组的表达及条件优化?.重组的分离纯化?.古菌属硫化叶菌晶体筛选与优化.:.实验结果.构建?和质粒?.重组的诱导表达?.重组表达的分离与纯化?. 的蛋白晶体?.第四节古菌属硫化叶菌的生化性质研究.
5、实验材料?.试剂?一.主要仪器?.实验方法.比色法测定古菌属硫化叶菌活性.古菌属硫化叶菌的最适温度与温度稳定性的测定?.古菌属硫化叶菌的最适与稳定性的测定.实验结果.重组表达的古菌属硫化叶菌具有氨肽酶活性?.古菌属硫化叶菌的最适温度与温度稳定性?.古菌属硫化叶菌的最适只霉博士学位论文本章小结?.第三章和抑制剂的筛选以及活性先导化合物的药效评价和机制研究第一节人抑制剂的筛选.实验材料.细胞株与试剂.主要仪器?.实验方法?.荧光分析法测定化合物酶抑制活性.法测定化合物抑制肿瘤细胞增殖活性?.实验结果?.肉桂酰亚胺类及四氢异喹啉类化合物的酶抑制活性?.肉桂酰亚胺类及四氢异喹啉类化合物的抑制肿瘤细胞增
6、殖活生.第二节候选抑制剂的药效及机制研究.实验材料.细胞株与试剂?.主要仪器?.实验方法.对各亚型的抑酶活性评价及分子对接?.法检测对组蛋白乙酰化水平的影响.实验.细胞周期分析.细胞凋亡分析. 法检测凋亡通路相关蛋白的表达. .活性检测细胞的.细胞划痕实验?。.细胞侵袭实验?.人乳腺癌.细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立.能显著诱导组蛋白的乙酰化水平升高.能显著抑制多种肿瘤细胞增殖.能诱导乳腺癌细胞周期阻滞?.能诱导乳腺癌细胞凋亡?.影响细胞周期及凋亡相关信号通路蛋白的表达?. 的活性?.能显著抑制.细胞的.能抑制.细胞的的激活?.能抑制.细胞的迁移?. 细胞侵袭?. 能抑制.能显著抑制.裸鼠移植瘤
7、的生长?.第三节候选抑制剂系列的药效评价?.实验材料 .细胞株与试剂?.主要仪器一.实验方法?. 对各亚型的抑酶活性评价?。. 试验.细胞周期分析?。.人乳腺癌.细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立。.人结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立.实验结果.系列对各亚型的抑酶活性结果?.系列能显著抑制多种肿瘤细胞增殖?.系列对.细胞周期的影响?.能显著抑制.裸鼠移植瘤的生长。. 能显著抑制 裸鼠移植瘤的生长第四节抑制剂的筛选及候选的药效机制研究一只霉博士学位论文.实验材料.细胞株与试剂.主要仪器. .实验方法.抑制剂的虚拟筛选与候选化合物的酶活测定?.候选化合物的酶抑制常数测定.人肿瘤细胞测定候选化合物的抑酶
8、活性.试验.细胞周期分析.细胞凋亡分析?.细胞侵袭试验?.实验结果.具有较好的抑制活性.候选化合物的酶抑制常数.对人肿瘤细胞表面具有很强的抑制活性. 能抑制多种肿瘤细胞增殖.诱导细胞周期阻滞?一.诱导细胞凋亡?.抑制细胞侵袭?.本章小结. 全文总结与展望参考文献【谢?.攻读学位期间发表的论文?已发表的代表性论文.沦文论文学位论文评阅及答辩情况表.?.?. . ?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?. .?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?. .?.?.?.?.?.?.?. ,.?. , 只霉博士学位论文.。.?。,.?.?.?.?. .?.?. ?.?.一.?.?。.,.
9、 .?. .,.?厶 车博士学位论文.?.。.?”.。.?.?.广.?。.?。.?.?. .?.。.?.?.?。?. . 鬈博士学位论文?。.?.?。.?”,”?.。.?.?.?.?。. . . .?.?.?.?。.?.。.芰季博士学位论文?.:.?. .?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?. .?.?.?.?.?.?.?.一 .?.?.?.:;. 季博士学位论文?.?. .?. . .?. .?.?. ?.?. .?. .?.?.呈博士学位论文.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?. .?。.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.季博士学位论文基于结构生物学的金
10、属蛋白酶抑制剂类抗癌药物的发现与活性研究专业: 药物化学研究生: 冯金红导师: 徐文方教授摘要第一部分研究背景,是机体正常细胞在多原因、多阶癌症锄即恶性肿瘤段与多次突变所引起的一大类疾病。癌细胞的生长和分裂速度高于正常细胞,生长失控,且会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部位。肿瘤的发生、发展过程极其复杂,多种金属蛋白酶起到非常关键的作用,在肿瘤演进的各个环节,几乎都能检测到其高水平表达,特别是肿瘤的浸润与转移过程。金属蛋白酶是活性中心含有金属离子的蛋白酶的总称,肿瘤生物学研究表明,金属蛋白酶家族中的两类锌离子依赖性金属蛋白酶:组蛋白去乙酰化酶.,/ 与,和氨肽酶
11、肿瘤的发生发展过程关系密切。在肿瘤细胞中,的过度表达导致组蛋白与结合力增强,从而引起染色体异构,影响基因转录。与此同时,过度表达的能抑制细胞周期抑制因子圮的表达,降低肿瘤抑制因子,的稳定性,并且促进肿瘤细胞中的缺氧诱导因子.和血管内皮细胞生长因子 ,的表达。研究发现,抑齐通过抑制的酶活性,能有效抑制肿瘤细胞增殖,导致细胞周期阻滞,并诱导细胞凋亡。因此,已经成为抗癌药物设计的新靶标,也已成为治疗肿瘤的有效化疗药物。为锌 互博士学位论文离子依赖性的型膜结合金属蛋白酶,参与激活生物活性肽、降解细胞外基质、参与抗原递呈等多种生物学过程。研究发现在肿瘤细胞表面高度表达,在肿瘤细胞的侵袭与转移过程中发挥着重要作用。通过降解细胞外基质,促进多种生长因子的释放,加速肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞侵袭与转移。此外,刺激血管内皮细胞释放肿瘤微血管形成相关因子,促进肿瘤新生血管的形成。因此,抑制剂也有望发展成为一类新型的抗肿瘤药物。本研究拟以和/为作用靶点,以结构生物学为手段,通过对肿瘤发生、发展和肿瘤新生血管生成具有重要影响的生物大分子和/蛋白的克隆、表达与纯化,并进行单晶培养,获得其三维结构信息,从而为蛋白质功能研究及相关药物设计提供帮助。基于结构生物学的药物发现,也就是基于受体的药物发现,是指一般应用由.射线衍射、核磁共振或分子模拟同源蛋白建模法等提供的受体三维结构信息,来辅助寻找、设计能够与它发
