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1、精心整理摘要：本试验以土壤中的微生物作为原材料，依据微生物各自的生长特点，配制不同成分的微生物造就基。将微生物造就物或含有微生物的样品在无菌条件下移植到造就基上造就，在分别出相应微生物后，对其进展进一步的纯化，然后视察其形态特征，并通过微生物的生理生化反响对其种类进展鉴定，最终探究环境条件对微生物生长的影响。 关键字：造就基，分别，纯化，鉴定，环境条件一、 试验材料1、分别细菌、真菌、放线菌的材料：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。别致土壤；造就基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂造就基、淀粉琼脂造就基、马铃薯蔗糖造
2、就基10mL装；试剂：5000U/mL链霉素液、0.5重铅酸钾液。2、细菌、真菌、放线菌纯化与鉴定的材料：菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌，前试验分别的未知菌；造就基：淀粉造就基、硫化氢试验造就基、石蕊牛乳造就基、油脂造就基；试剂：碘液。菌种：枯草杆菌斜面；灵杆菌菌液；黑曲霉斜面。造就基采纳：牛肉膏蛋白胨斜面造就基牛肉膏蛋白胨琼脂造就基10mL、马铃薯蔗糖造就基10mL、淀粉琼脂造就基10mL；供试药剂：2.5碘酒，75酒精，0.1HgCl2，5石炭酸。二、试验步骤1、分别细菌、真菌、放线菌的步骤一、造就基配制l. 造就基配制的一般方法和步骤1称量：遵照造就基配方，正确称
3、取各种原料放于搪瓷杯中。2溶化：在搪瓷杯中参加所需水量依据试验须要参加蒸馏水或自来水，用玻棒搅匀，加热溶解。3调pH值调pH也可以在加琼脂后再调，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸参照。4加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并限制火力不要使造就基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。5分装：在漏斗架上分装。依据不同的须要进展分装，一般制斜面的装置为管高的15 特殊留意不要使造就基粘污在管瓶口上以免浸湿棉塞，引起污染。6包扎成捆、挂上标签。造就基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配造就基名称的标签。7灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下
4、磅后取出，摆成斜面见图6-1。造就基经灭菌后，必需放在37恒温造就箱中造就 24h，如确无菌生长、方可运用。2三种造就基的配方及详细配制方法1. 牛肉膏蛋白陈琼脂造就基用于分别和造就细菌，是一种自然造就基。配方：牛肉膏 3g蛋白胨 5g氯化钠3g琼脂20g自来水1 000mLpH7.2 7.4灭菌l.05kgcm2，2530min本试验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30牛肉膏、50蛋白胨、30氯化钠。以配制200mL造就基为例。吸取30牛肉膏2mL；50蛋白胨2mL；30氯化钠2mL；参加有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调 pH至 7.4，
5、加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，见图62。装带有棉塞的无菌试管，装置15的试管高度共12支，作斜面造就基、用铝壳试管帽的里装10mL。约试管高度的 12以上，用作分别时倒平板用。分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆图6-3，挂上标签，灭菌备用。2. 马铃薯或豆芽汁蔗糖或葡萄糖琼脂造就基用于分别和造就真菌之用，是一种半合成造就基。配方：去皮马铃薯或鲜豆芽200g蔗糖或葡萄糖20g自来水1000mL琼脂20gpH自然灭菌含蔗糖1.05kg/cm220min含葡萄糖0.1kg/cm2 30min制备方法配制200mL造就基为例取上皮马铃薯40g，
6、切成小块、放入无刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置电炉上加热煮沸10min，用4层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200mL。然后加蔗糖4g，加琼脂4g，加热熔化并用玻棒不断搅拌直至琼脂完全溶化分装试管，下面一系例步骤同配细菌造就基一样。3. 淀粉琼脂造就基高氏一号GauseI，用干分别和造就放线菌，是一种合成造就基。配方：可溶性淀粉 20.0gKNO31.0g K2HPO4 0.5gMgSO47H2O 0.5gNaCl 0.5gFeSO47H2O 0.01g琼脂20g自来水1 000mL灭菌1.05kg/cm230min制备方法配制以配制200mL造就基为例：吸取配方液：1KNO3
7、20mL；1K2 HPO410mL；1MgSO47H2 O10mL；lNaCl10mL；1FeSO4 7H2O0.02mL加水补足至 200mL，置电炉上加热.用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4g，从200mL中取出少量参加淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后将淀粉糊洗入造就液中，搅匀，调pH至 7.4，加琼脂 4g，加热至琼脂完全溶化为止，趁热分装试管，以下一系例步骤同于配制细菌造就基的操作方法。3. 无菌水的制备无菌水，为下一次微生物分别试验中所需用而打算。100mL三角瓶装有玻璃珠，装自来水45mL，试管中装9mL自来水，塞上棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。二分
8、别造就微生物常用器皿的打算1. 清洗一些玻璃仪器：如三角瓶试管，造就皿、吸管等。2. 棉塞的制作：装造就基和分别造就需用的局部玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，幸免污染、试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约1-2mm处，用解剖针塞入少许棉花，约1-1.5cm 长以防止细菌吸入口中，井幸免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧相宜。吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。3. 包装造就皿和吸管等。为了使造就皿、吸管、三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让外表暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当见示范，每组同学包造就皿6
9、只一包。吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在45cm宽的长纸条的一端，约成45角左右，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，打算灭菌。三微生物的分别1. 用稀释平板法又名混菌法从土壤中分别真菌。1制备土壤稀释液无菌操作过程见教师示范。A. 取土壤5g，放入装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10-1的土壤悬液。B. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止 0.5min，用无菌吸管吸取 1mL土壤悬液参加
10、 10的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法由10-2的试管中吸取1mL稀释液参加编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6土壤稀释液。在土壤稀释过程中，以用一支吸管由浓到稀，稀释究竟，稀释方法见图7-1。图71 检样的稀释方法2每组取无菌造就皿2付，即每个同学做一只。学号单号学生用10-5稀释度液，双号学生用10-4稀释度液。先在无菌造就皿底部贴上标签，注明分别菌名、稀释度、组别、班级。取另一吸管，以无菌操作法吸取10-4或10-5土壤稀释液1mL，加在无菌造就皿的一边，在皿的另一
11、边参加 2滴 5 000U/mL的链霉素液。此时严防两液相混。取已溶化在水浴锅中保温50oC左右的马铃薯蔗糖琼脂造就基2 管10mL装，一管倒一皿，以不烫手为准，倒入上述造就皿中见图7-2，轻轻转动造就皿，使菌液、链霉素液、造就基充分混匀铺平皿底，放在平坦的桌面上，凝固后，翻转造就血，置2830oC恒温造就养56d。视察真菌菌落形态以及计数菌落数。并计算出每1g土壤中真菌的数量。即用某一造就皿内真菌的菌落数乘以该造就皿接种液的稀释倍数即得。3挑取单个菌落接种到外面造就基上作纯化和性能测定，假设不纯，须要接着分别。2. 用平板涂抹法分别土壤中的放线菌土壤稀释液制备同上。每组取无菌造就皿2付每个同
12、学各做一只。各在造就皿底部贴上标签，注明分别菌名、稀释度、组别、班级。以无菌操作法先在造就皿中参加0.5重铅酸钾溶液2滴，取已溶化的淀粉琼脂造就基2管，分别倒入2付造就皿中，轻轻转动造就皿，使造就基与重铅酸钾充分混匀，铺平，制成平板。待平板凝固后，另取一支吸管吸取10-3单学号学生或10-4双学号学生稀释液0.2mL土壤稀释液放在平板上。取无菌三角玻棒，把上述稀释液在平板外表涂抹匀称见图7-4。在涂抹时不要弄破平板，以免影响菌落的生长。翻转造就皿，置2830条件下造就67d，视察放线菌菌落形态及计数菌落，并算出每g土壤中放线菌的数量方法同上。挑取单个菌落，接种于相应的斜面造就基上，假如不纯再移
13、植或纯化，直至得到纯造就为止。3. 用平板划线法分别土壤中的细菌土壤稀释液的制备同上。1每组取无菌造就皿两付，同上法在造就皿底部贴上标签。取已溶化的牛肉膏蛋白胨造就基，倒入无菌造就血中，制成平板。2平板凝固后，用接种环取相应的菌液一环10-5或10-6在平板上划线教师作示范连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板造就基外表作连续划法图7-5，勿划破造就基。划线完毕后，倒置28oC30oC温室造就。分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在平板造就基的一边作第1次平行划线3- 4条，再转动造就皿约60”角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线局部作第2次平行划线，再用同法通过
14、第2次平行划线局部作第3次平行划线和通过第3次平行划线局部作第4次平行划线见图7-5划线完毕，盖上皿盖，倒置于28-30温室中造就。3挑取单个菌落接种子斜面造就基上，假如不纯再移植成纯化，最终得到纯造就。用上述分别土壤中真菌、放线菌和细菌的方法，也可用于分别病虫、病蚕或果蔬上的病原菌。以划线法从病蚕分别黑胸败血病病原菌为例，先用75酒精棉球进展外表消毒留意病虫、病蚕、果蔬等分别的样品不要过份腐烂，便于进展材料的处理。取灭菌手术剪剪去病蚕的一只腹足，流出体液作为划线分别的材料，假设是分别苹果炭疽病病原菌，那么用无菌镊子揭下有炭疽病苹果的果皮，再从今处切取米粒大小果皮1块，放入盛有1mL无菌水的试
15、管中，用无菌玻棒捣碎制成悬浮液，划线法分别病原菌。图75 平板分别划线的方法A. 连续划线法B. 分区划线法2、细菌、真菌、放线菌纯化与鉴定的步骤一淀粉水解试验某些细菌可以产生淀粉酶胞外酶，使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌汲取利用。淀粉水解后遇碘不再变蓝色。试验时将装有淀粉造就基的三角瓶置于洗水浴中溶化，然后取出冷却至约50左右，即倾入造就皿中，待凝固后制成平板。每个同学用接种环取少量菌涂在平板上，每个菌种涂片 0.30.5cm大小的圆见图 9-1、其中一种应以枯草杆菌Bacillus subtilis作为参照菌。图91 淀粉水解试验接种示意图1. 枯草芽孢杆菌 2. 试验菌1 3. 大肠杆菌 4. 试验菌2将造就皿倒置于37恒温箱中造就24h，视察时翻开皿盖滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液匀称铺满整个平板。如菌体四周出现无色透亮圈，那么说明淀粉已被水解。透亮圈的大小，说明该菌水解淀粉实力的强
