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1、7PIT! MI.V1U4fJ LW_f f -MC- *-J4杠flHITrirffmaf.RhHmi Eli 書序11 趴电士啣暫却n.黑rttifcOK *：. 程 F Li .PR v-as Hi?,HB-ii ff* 墨.1 BHH.HBI: 7 十 I -l . 齐 M MA T1 tifiKtiA 亡町1畳电曜岫量曲上片iiMR. f - rrt Afein.11111*11 44u 丄 #!PM *囱n 蛮* H Fq p. 町tltai EL .UR-kHRQ.il jidm-lrK-t .* a p.44j(! 4H-Miq nwwm p- 耳斗 匕 If 卜 I taB.
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3、111看丿42片IBMRII l BUN Jit HI .CHKrELMB电子显微学报 J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第 29 卷图I气体CO:冷冻装置。Fig.lGas C02frozen equipment.镜下操作后，置于干冰上（临时无干冰，也可置于一80C冰箱,待冷冻完全后，将样 品移至冷冻切片机中，温度平衡后，将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。冷 冻包埋模具见图2。图2冷冻包埋模具。Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。 将组织块置于样品台的OCT中，为防止组织块爆裂，先
4、在液氮中迅速浸提几次，时间从 1s 开始逐渐增加 , 直至样品温度与液氮温度平衡 , 之后移至冷冻切片机中 , 使温度 与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机（箱体温度 在一20C以下中直接冷冻。3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80C冰箱中取出,室温放 置10min,待切片回温并干燥，浸于PBS中10min洗去OCT，可以无需Triton处理，即 可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口。反应在避光湿盒 中进行，反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。先用荧光显微镜观察，确认标记 成功,移至激光共聚焦显
5、微镜扫描成像。4 荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素（fluoresein isothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC,ex550nm/em 620am、罗丹明（Rhodamine,ex560nm/em540660nnl、四甲基 罗丹明（tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595 600nm、德克萨斯红（Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素（Aminomethylcoumarin acetic acid,AMCA,ex345 nm/em4
6、25am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展，这些经典的 荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。如Cyanine类荧光染料，其中Cy3 （ex554nm/em568nm的激发峰值更接近于新型固体561am激光器，且比TRITC等更 亮、更稳定，已被广为应用于免疫荧光抗体标记旧1；Alexa Fluor系列荧光染料激发 和发射光谱窄，可用于多重荧光标记而更少光谱重叠;ATTO系列荧光染料具有较强 的光稳定性和热稳定性，已被应用于STED （Stimulated Emission Depletion受激发射 损耗超高分辨率显微成像技.IDyLigh、CF等更多新型荧光染料系列都将因其较 高的激
7、发效率、良好的光稳定性、宽泛的 PH 稳定性等优越的特性而被广泛的应用 于组织及细胞免疫荧光标记。组织切片的细胞核标记目前仍然采用DAPI（4, 6 联脒一 2-苯基II引哚,ex359nm/em461am,其特点是专一性强、灵敏度高、稳定性好、毒性小,且可被405am激光器有效地激发，获取明亮的核标记荧光图像。PI（碘化丙啶 ex536am/em61711m也可以用于核标记，因其可识别DNA和RNA,核染色前须进行适 当的RNA酶处理。TOTO系列、YOYO系列荧光染料也可作为组织细胞核荧光染 料。表达荧光蛋白的组织经冷冻切片制样后，可直接封片，观察并扫描图像，也可配合 使用其它荧光染料进行
8、免疫荧光抗体标记和核染色。同时表达GFP和RFP荧光蛋 白的组织切片，如还需作免疫荧光抗体标记,应选择可以被633am和405nm波长激光 器激发的荧光染料，如CY5、Alexa fluor633和Alexa fluor405等。5样品制备中相关实验方法400用于免疫荧光抗体标记组织切片的载玻片需爲血Midi耳 W AH LLKna.irrllEcEHam e& 1鼻一*#.匕，甲b. V!E 的hL*!)uvi口 HMfftnKaliP J f 梔口 UBW J。區見hr#亠.A .4 HiliV-f RfimB- .EHM .HIfT, i iwnftVJB j-j s.fK i- Hia
9、af催期由匸*JLL|*科崛豪槽圍用曲丄LIH* ii.J TIHf.TH-HH.I-lk!l I LAV H1.IVW. 1 ItllLlHHE IP fl tHffi fW IE上峠鼻占 IHRKIJB fK F 144 MJiift.l Maa E_b隈鼻-丄弋场J.*H-Ek.ir K.KI A .啊 M-屯*炳.-H l *l VI -i. -a 1 h.FDrrfia.taKRiA 44. DRS AVU CKHqfl.riHiEu.Ha.mmuHn?ritaiifam洞虬1-L Is. Vfli iJII.9L9CT IHJI- 1 V 乂 =E r ftV I田厂穴IE#.萱4
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11、 I I HPEV. *!*. 91*|n. thj aft i HFLiaH-t-VlCfl-4!|l!imm 1 .! Ikh!1昌田下, ! Td fcw|McLhnd nF s&implc prepurxlinn fur teir sw-&nnfinM阳I mlCfOSnJflrtd)Kmple o F I jbw sec lion4* Mem. d iBJIa# Hi A Ifek.UW-5.Oa-H BWiOttilrn FRHie激光共聚焦显微镜样品制备方法（二组织切片样品作者:边玮,BIAN Wei作者单位:中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上 海,200
12、031刊名：电子显微学报英文刊名 JOURNAL OF CHINESE ELECTRON MICROSCOPY SOCIETY年，卷（期:2010,29（4参考文献（5条1斯佩克特D L.戈德曼R D.莱因万德L A.黄培堂细胞室验指南20052余礼厚激光共聚焦显微镜样品制备方法（一一一细胞培养样品2010（23汪尔康生命分析化学20064. Punge A.Rizzoli S O.Jahn R3D reconstruction of high-resolution STEDmicroscope images 20085. Harlow E.Lane D Antibodies:A Laboratory Manual 1988本文链接:http:/
