克隆技术的发展

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1、克隆技术的发展史克隆是英文clone或cloning”的音译，而英文clone则起源于希腊文Klone，原 意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。在大陆译 为“无性繁殖”在台湾与港澳一般意译为复制或转殖或群殖。中文也有更加确切的词表达 克隆，“无性繁殖”、“无性系化”以及“纯系化”。克隆技术的概念克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同 的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织 后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术， 其本身的含义是无性繁殖，即由同一个

2、祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系 中每个细胞的基因彼此相同。克隆也可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗 传基因与原型完全相同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后 代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但 克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生 物体产生后代的生殖方式，常见的有抱子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、 叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子

3、和牛等动物没有人工 操作是不能进行无性繁殖的。早期研究目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多利”， 以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移 植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植 到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞 核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核 移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯施佩曼在1938年提出，他称之 为“奇异的实验”，

4、即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核， 将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪 和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼 类胚胎细胞核移植技术，获得成功。1964年，英国科学家格登（J.Gurdon）将非洲爪 蟾未受精的卵用紫外线照射，破坏其细胞核，然后从蝌蚪的体细胞一个上皮细胞中吸 取细胞核，并将该核注入核被破坏的卵中，结果发现有 1.5%这种移核卵分化发育成为 正常的成蛙。格登的试验第一次证明了动物的体细胞核具有全面性。哺乳动物胚胎细胞核移

5、植研究的最初成果在1981年取得一卡尔伊尔门泽和彼 得霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩维拉德森用取自羊的未 成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物 对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。 1994年，尼尔菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年， 在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚 胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。以上事实说明，在1997年2月，英国

6、罗斯林研究 所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已 经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全 部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出 生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了， 同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物 质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有 无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细 胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大

7、规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供 了有效方法。在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁 狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界 乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国 政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的 巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究 与开发进入一个高潮。近年来克隆研究的重要成果克隆羊“多利”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接 连不断。1997年3月，即“多利”诞

8、生后近1个月的时间里，美国、中国台湾和澳大利亚 科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进 行克隆，其意义不能与“多利”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改 造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊 “波莉（Polly）。 这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。1998年7月，美国夏威夷大学 Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了 27只 成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多利”以后的第二批哺乳动 物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多利”不同的、新的、相对

9、简单 的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息； 日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿 大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企 业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、 卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至 1999年底，全世界已有6种类 型细胞一胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管/子宫上皮细胞、肌肉细胞 和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。2000年

10、6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但 其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究 所得，与克隆“多利”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技 术。在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯 康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五 种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成 熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。 1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我

11、国科学家也用兔卵子克 隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条 新途径。我国克隆技术发展简史1965年生物学家童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植。1990年1.西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。1992年1.江苏农科院克隆一只兔子。2.中科院克隆了一只青蛙。（实验失败）1993年中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院携手合作，克隆一只山羊。1995年1.华南师范大学与广西农业大学合作，克隆一头奶牛和黄牛的杂种牛。2.西北农业大学畜牧所克隆六头猪。1996年1.湖南医科大学人类生殖工程研究所克隆六只老鼠。2.中国农科院畜牧所 克隆一头公牛。（以上为胚胎细胞克隆研究

12、）1999年1.中国科学家周琪在法国获得卵丘细胞克隆小鼠，在国际上首次验证了小 鼠成年体细胞克隆工作的可重复性，于2000年5月用胚胎干细胞克隆出小鼠“哈尔滨”， 并于2000年10月获得第一只不采用“多莉羊”专利技术的克隆牛。2.中国科学院动物研 究所研究员陈大元领导的小组将大熊猫的体细胞植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育 出了大熊猫的早期胚胎。1999年和2000年扬州大学与中科院发育所合作，用携带外源基因的体细胞克隆出 转基因的山羊。2000年我国生物胚胎专家张涌在西北农林科技大学种羊场接生了一只雌性体细胞 克隆山羊“阳阳”。“阳阳”经自然受孕产下一对混血儿女，“阳阳”的生产可以证明体细

13、胞克 隆山羊和胚胎克隆山羊具有与普通山羊一样的生育繁殖能力。2002年我国首批成年体 细胞克隆牛群体诞生。在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、马铃薯、玫 瑰等插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术，则经历了由胚胎细胞到体细胞的发展过程。早在 本世纪50年代，美国的科学家以两栖动物和鱼类作研究对象，首创了细胞核移植技术，他 们研究细胞发育分化的潜能问题，细胞质和细胞核的相互作用问题。1986年英国科学家魏 拉德森首次把胚胎细胞利用细胞核移植法克隆出一只羊，以后又有人相继克隆出牛、羊、鼠、 兔、猴等动物。我国的克隆技术也颇有成就，80年代末，我国克隆出一只兔，1991年西北 农业大学发育研究

14、所与江苏农学院克隆羊成功，1993年中科院发育生物研究所与扬州大学 农学院共同克隆出一批山羊，1995年华南师大和广西农大合作克隆出牛，接着中国农科院 畜牧研究所于1996年克隆牛获得成功。而美国最近克隆猴取得成功，日本科学家也声称他 们繁殖出200多头“克隆牛”。以上所述的克隆动物，都是用胚胎细胞作为供体细胞进行细胞 核移植而获得成功的。奇妙的克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说

15、明。转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因 动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病 实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学 模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了 10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，56个药品进 入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没 有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转 基因动物有 性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的

16、优良胜状，是制约当今转 基因动物实用化进程的主要原因。体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅 速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术 实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体 细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的 外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞 中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移 植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100 %的阳性转基因动物。采用 此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有 人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因 整合率高达50%。Ci