《细胞工程复习重点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞工程复习重点（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一章细胞培养1、细胞系：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。2、细胞株：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。3、传代：体外培养细胞生长增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液（培养基），这一过程叫传代。4、基本条件：无菌无毒、营养需要、生长环境（pH值、温度、渗透压）5、设备：环境（无菌实验室、净化工作台、恒温培养箱、CO2罐）储存（液氮储存罐、液氮运输罐、超低温冰箱）处理（倒置显微镜、离心机、高压蒸汽消毒器、干燥箱、高温烤箱）6、培养基必须具
2、备的基本条件：营养物质、缓冲能力、等渗性、无菌7、生长状态指标：细胞生长曲线&生长倍数、细胞分裂指数、细胞接种存活率、克隆形成率&细胞生长曲线：接种培养一计数一制图；曲线近似“S”形，潜伏期一对数生长期一平台期；生长曲线反映的是某一特定培养条件下的细胞增殖规律。第二章肿瘤细胞1、癌基因的产物：原癌基因的产物主要包括：生长因子，如sis，生长因子受体，如fms、erbB，蛋白激酶及其它信号转导组分，如src、ras、raf,细胞周期蛋白，如bcl-1，细胞凋亡调控因子，如bcl-2，转录因子，如myc、fos、jun。2、原癌基因的描述判断：原癌基因是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生
3、命活动所必须的，在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。3、P53基因描述：转录调节因子；使癌细胞凋亡，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。4、肿瘤细胞体外培养的生物学特性：形态和性状（形态不规则，界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富|折光性强，表面微绒毛多）生物特性（营养要求不高，自分泌促增长因子，生长方向性消失、失去接触抑制，细胞倍增周期短）永生性、侵润性、异质性、细胞遗传性。第三章污染控制、冷冻保存1、细菌、真菌污染的控制：过滤除菌（0.22卩）、抗生素（预防用药：双抗生素-青霉素，链霉素，真
4、菌：两性霉素B;污染后清除用药（在污染早期可能有效）：需采用大于常用量5-10倍的冲洗法，于加药后作用24-48小时，再换常规培养液。）2、支原体污染的用药控制：抗生素（Cip,BM-1+BM-2,M-plasmocin）方便经济有效、加温处理、支原体特异的抗血清3、细胞冻存和复苏的方法步骤:冻存：常规技术消化并收集细胞于离心管中离心；去上清，逐滴加入4预冷的冻存液，轻轻重悬细胞后，均匀分装于冻存管中，做好标记；尽快将冻存管装于纱布袋中，悬于液氮液面上方或低温冰箱(-70)过夜；次日转入液氮中。复苏：从液氮罐中取出冻存管一一迅速放入38C水浴中，并不时摇动，在1分钟内使细胞完全融化一一无菌条件
5、下逐滴转移至加有适量培养液的离心管中一一根据细胞的要求离心，弃上清一一加入适量培养液，轻轻重悬细胞，接种培养过夜(接种浓度一般106/ml)次日更换培养液，继续培养，并观察生长情况。污染类型主要特征主要来源检测方法细菌塔养潼：愛黒浊，pH改麦可能丸鸩昱愛代最后变厨脱落死亡*抹作不慎。肉眼勺鏡下观獴：貢菌再準可見白邑玉逵背邑妁小点.培算抿一農不璋浊.期下可監舸e生隹畫慢.載奏売上.耳养新(水楷)，培泰用具；受孚节劈呦軽火(舞雨孚节摟种壇养.支原体极易产生变叉疔束.血淸(尤其是国产血清)口侃灌业理地衣斬/娄丸樂隹；也橇/培器捡测病毒污亲率欣发乱，甘培秦用致把*弓能氏期用电褰軽坯累。原孔培养的俎戡斑
6、跑血請.-)细胞两切施圭，第鼻抽斗亦两种M雎的混合母息刁孜生養芾松戦葩的闻也祓浴松企的讯胞取焉真之齋材芍君浪其用，操杵不当镜丁观察：细胞基尢化学污染何絕4、鬟不餐，越内额捉输增券.产重甘金挖亡.培养用器新清冼消毒不釉風*钱丁观察。第四、五章一、病毒感染细胞测定方法：检验标本t杀灭杂菌(青、链霉素)t检测病毒的存在：接种易感的动物t出现病状；鸡胚t病变或死亡；细胞培养t细胞病变t鉴定病毒种型(血清学方法)。繁殖指征一一(1) 细胞致病作用(Cytopathiceffect,CPE)(2) 红细胞吸附现象(Hemadsorptionphenomenon)(3) 干扰现象(Interfereneep
7、henomenon)(4) 包涵体(Inclusionbody)形成(5) 代谢生长抑制(Growthinhibition)(6) 细胞转化、出现转化灶”(Transformation)可腿病毒疮染此拔枪測捕毎感渠如胞此拔枪測捕毎感渠如胞*.采集标本I也藝雀劉密*卿柱病虽威学检测抗体的检测抗凍植酸中和试擊氏栽押制试峻呀联免滾瞅附试脸蛋白印谨试脸二、免疫酶染色法1、病毒感染细胞的检测方法：免疫酶染色法：链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（SABC法）；灵敏性高，对比度佳。2、免疫酶染色法原理Step1:特异性第一抗体+组织细胞标本共孵育；Step2：通过生物素化第二抗体与第一抗体结合；St
8、ep3:借助亲和素与生物素的天然亲和性，将多个生物素化辣根过氧化酶连接为一个ABC复合物；Step4：复合物中亲和素结合二抗上的生物素，介导ABC复合物结合到抗原抗体复合物上。加入显色底物后，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。3、免疫酶染色法主要材料：（1）磷酸盐缓冲液洗涤（2）Tris-HCI缓冲液-配制底物溶液（3）底物溶液（现配现用）-显色（4）ABC试剂盒（二抗+ABC复合物）-包含所需的专用试剂（5）抗体（一抗）-结合标本中特定的抗原（6）器材4、基本步骤：细胞准备与固定一一过氧化氢处理一一PBS振洗一一封闭一一一抗标记一一振洗+二抗标记一一振洗+ABC复合物一一振洗一一细胞核衬
9、染一一逐级脱水一一透明一一封片5、注意事项：对照设置、DAB显色、封片与脱水二、传代细胞生长过程的分期：游离期一一贴壁期一一潜伏期一一对数生长期一一停止期（平台期）三、转化细胞的特征及检测方法1、特征：遗传性状改变2、检测方法：四氮唑盐（MTT）比色法（细胞活性）、流式细胞术（测定DNA合成）、3H-TdR掺入法、PCR细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法）、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入实验第六、七章细胞调亡、大规模培养2、细胞大规模培养需要控制的要素：（1）动物细胞培养的环境：温度、pH值；（2）营1、细胞坏死概念：细胞非正常死亡，由于细胞内含物释放到细胞外，导致炎症。细胞坏死被认为是
10、因病理而产生的被动死亡。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。养成分；（3）溶解氧；（4）渗透压等其他因素天然培养基：优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。合成培养基：既能提供一个近拟于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。第八章细胞融合诱导细胞融合方法病毒类DKA病毒：水痘和疱疹病毒.天花（免天花）病毒R从病毒：仙台卩门病SiNDV,腮腺炎病毒“S5w麻疹及呼吸道合胞病毒KNA致癌病奇*Rous肉瘤病盍.VisnaS冠状病毒：煞类感染性气管炎病毒化合物水溶性*聚乙二酵（I-EG）、二甲亚讽
11、（DMSO）“ConA脂溶性*溶血卵磷脂、磷脂酷丝氨酸电脉冲直流电脉冲1、细胞融合剂：（1）仙台病毒：凝血活性和唾液酸苷酶活性优点：适用范围广，病毒易培养。缺点：制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率低、病毒对细胞的生命活动产生干扰。适用于动物细胞融合，用于实验室研究。（2）聚乙二醇：PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，在质膜之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连，进而促使质膜的融合。PEG能增加类脂膜的流动性。优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒
12、害。（3）电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小。装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程。免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。2、细胞融合的具体步骤：（1）细胞准备：贴壁细胞，两亲本细胞混合培养；悬浮细胞，制成一定浓度的细胞悬浮液。（2）细胞融合：加融合剂于待融合细胞中，诱导融合。（3）杂种细胞选择：利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，杂种细胞存活。（4）杂种细胞克隆：对选出的杂种细胞进行克隆，培养出所需要的无性繁殖系。从而对物种资源的开发和利用具有为远缘物种间的遗传物质交换提供在杂种的分裂和增殖过程中双亲3、细胞融合的意义：任何细胞都有可能通过体细胞杂交而
13、成为新的生物资源，深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。B细胞克隆所产生的结构与4、单克隆抗体的定义：由一个识别单一抗原决定簇（表位）的功能完全相同的同源抗体。优点：以标记抗体为特点的免疫学方法缺点：不能进行沉淀和凝集反应免疫反应：多抗优于单抗；抗原鉴定,特异诊断：单抗优于多抗5、制备单克隆抗体的技术和过程：技术：细胞融合技术、融合细胞筛选技术、过程：融合前的准备工作细胞融合杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的扩增、冻存
14、和克隆化单克隆抗体的大量制备第九章核移植，动物克隆第十章转基因动物与生物反应器1、转基因动物生物反应器：2、转基因技术方法：电穿孔法（简单、效率较高）、显微注射法（随机，基因重排、易位、缺失或定点突变）、裸露DNA直接注射、磷酸钙一DNA共沉淀法（转移效率低）、脂质载体包埋法（效率高）、病毒介导的生物学方法3、培育转基因动物的方法：基因的显微注射法、胚胎干细胞方法、反转录病毒法4、乳腺生物反应器：制备：（1）表达载体的构建：启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件；（2）目的基因的选择；（3）体外重组；（4）基因转导；（5）胚胎移植；（6）鉴定优点：产品质量稳定、产品成本低、研制开发周期短、
15、无污染、经济效益显著问题：（1）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分离和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题（6）伦理道德问题第十一章胚胎工程1、xy差别性别控制原理和依据:原始生殖细胞（Primordialgermcells，PGCs）就是指能发育为精子或卵子的祖先细胞。在迁移过程中PGCs不断分裂增殖，随胎龄增长，性别发生分化，在雄性，生殖嵴演变为睾丸，PGCs形成精原干细胞，而后附着在生精细胞上皮进入精子发生过程；在雌性，生殖嵴演变为卵巢，PGCs分裂形成卵母细胞。，最终形成精子和卵子。XY时，Y染色体短臂上有睾丸决定因子，此因子使生殖细胞经过增殖期、生长期和成熟期睾丸的发生：若胚胎细胞的性染色体为未分化性腺向睾丸发育卵巢的发生：若胚胎细胞的性染色体为XX时，则未分化性腺自然向卵巢方向分化2、皮质反应与透明带反应：精卵融合时，诱导卵膜特性发生改变，可阻止第二个精子
