《苯酚硫酸法测定多糖》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苯酚硫酸法测定多糖（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1. 原理分子量大于10, 000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高 分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下， 有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。2. 适用范围参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。3. 仪器(1) 分光光度计(2) 离心机(3) 旋转混匀器(4) 恒温水浴锅4. 试剂除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。(1) 80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。(2) 2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L，加入固体无
2、水硫酸钠至饱和。(3) 铜贮存液：称取3.0 g CuSO4 - 5H2O，30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存2 周。(4) 铜应用溶液：取铜贮存液50 ml，加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。(5) 洗涤液：取水50 ml，加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混匀。(6) 1.8 mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。(7) 20 g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。(8) 葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖(分子量500,000D)于称量皿中，105C干燥4h
3、至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容 至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0 mg/mlo(9) 葡聚糖标准应用液:吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/mlo5. 操作方法5.1样品处理(1) 样品提取：称取样品15g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml (V1)，混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。(2) 沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml (V2)，置于烧杯中，加热浓缩至10ml， 冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣 用80
4、%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。(3) 沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml (V3)，混匀后过滤，弃初始滤液后， 取滤液2.0ml (V4)，加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim， 冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。(4) 测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL (V5)。准确 吸取2.0ml (V6)，置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，沸水浴煮沸2 分钟，冷却比色。从标准曲线上查得相应含量，
5、计算粗多糖含量。5.2标准曲线制备：精密吸取葡聚糖标准应用液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml (分别相当 于葡聚糖 0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg)，补充水至 2.0mL，加入苯酚 溶液1.0ml，浓硫酸10ml，混匀，沸水浴2分钟，混匀，沸水浴2分钟，冷却后用分光光度 计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度值(A)，以葡聚糖浓度为横坐标，A 为纵坐标绘制标准曲线。6. 计算从标准曲线上查得样品相应含量，计算粗多糖含量。cxV5xV3xV1x0.1cx250葡聚糖（%）= = -
6、V6xV4xV2xmm公式中：c-从标准曲线上查得样品测定管中葡聚糖含量，mg；V1-样品提取时定容体积，ml；V2-沉淀高分子物质取液量，ml；V3 -沉淀葡聚糖时定容量，ml；V4 -沉淀葡聚糖时取液量，ml；V5 -测定葡聚糖时定容体积，ml；V6 -样品比色管中取样液体积，ml；m-样品称量质量，g；0.1-将mg/g换算成g/100g的系数。7. 注意事项（1）苯酚-H2SO4溶液可以和多种糖类进行显色反应，常用于总糖的测定。所以测定过程中 应注意容器及试剂中其他糖类的干扰。（2）苯酚-H2SO4溶液和不同类的糖反应，显色的强度略有不同，反映在标准曲线的斜率不 同。如果已知样品中糖的结构，应尽量以同类糖的纯品做标准品，或以含有已知浓度的同类 产品做对照品进行检测分析；如果样品中糖的类型未知或结构多样，则只能以葡萄糖计或其 他糖计报告结果。（3）试验证明葡萄糖、果糖等单糖，蔗糖、乳糖等双糖、低聚糖-棉子糖，淀粉、糊精等 多糖及甜味剂糖精不干扰粗多糖测定。（4）本方法由北京市卫生防疫站建立，经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所验证
