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1、HPLC流动相的缓冲液缓冲液流动相可以根据下而的操作步骤配制： 将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液（溶液A 用pH il确定或涮节溶液A的pH。将一定体枳（如200ml）的有机溶剂B与由步骤2配制的溶液A （如800ml）混合制成最终流动相（此 处的有机相为20%）。检査垠终流动相的pH （此处为选项）。由于测定含有有机涮节剂的流动相pH计发生潔移.使其测定pH不很可靠.所以上血的步骤4 一般只有在考察误差的主婆來源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。步骤1 一般是将配制缓冲液所用的两种试剂（A1和A2）分别按讣算址先溶解在水中制成水溶 液.然后再将这两种溶液按一定的比例混合得到预期pH的溶液儿
2、若在此步骤2中调节pH,则可以采用 溶剂A i商定溶剂B.也可反过來滴定并通过pH讣测址得到所需pH的报终缓冲溶液。在大多数实验室中, pH的测虽精度通常不会达到0.05-0.1个pH单位，这会显著影响一些样品的分离。“iHPLC方法对pH 非常敬感时，步骤2只能大致确定pH值。将准确称重的缓冲液配制试剂与精确体积的脱气蒸怖水混合使其成为均一的溶液（不进一步调整 pH）,如此配得得缓冲溶液得pH可以控制在非常窄得范圉内（土002单位），已知准确pH值得缓冲液浓溶 液已有市售。为了改善峰形或塔板数.有时在流动相中加入酸或碱（如三乙胺、乙酸等）.如果这些添加剂并非 为配制缓冲溶液时所采用得试剂，那
3、么将这些试剂加入到流动相中后，还需重新滴加酸或碱.使流动相达 到所需的pH值。常用缓冲液的配制片缓冲液被稀释或浓缩时，pH也应不变。其pH值应近似恒定不变，或为其中的离解的阳离子（K+. Na+）或阴离子（C卜、Br-）被其它种类的离子替换时.表1T 中给出响应的配制方法，平衡阳离子为 Na+缓冲液的最终浓度为0.lmol/L对于其它浓度的缓冲溶液或阳离子种类（通常K+）更好.表中的数 据也可供参考。较稀的或较浓的缓冲溶液.及包含有不同阳离子的溶液.其pH值会与表中的数据稍有出 入。在方法建立过程中，粘确的流动和pH值往往并不重婆.重要的是每次新配制的流动相的pH值与第一 次基木相同（最好控制
4、在土002范鬧内）。注熱 只有十缓冲溶液的pH在缓冲试剂解离常数pKIal范圉 内时.缓冲溶液才具有有效的缓冲容量（如乙酸盐的pKa=4.6.其适宜的pH范困为3656）。表1低pH值（25C）磷酸盐缓冲溶液的配制方法溶液Al： 0.1M磷酸。配制糖确pH值缓冲液时，所用磷酸需滴定H3PO4的含虽c 溶液A2： 0.1M磷酸二氢钠溶液，称虽138g NaH2PO4H2O溶解于水中.定容于1L容虽瓶中。PH2.0A体积(ml)A2体枳(ml)2.8pHAl 体积(ml)A2休枳(ml)5654351758252.24555453.01108902.43456553.2559452.6250750
5、表2不同pH值（259）醋酸缓冲溶液的配制方法溶液Al： 0.1M醋酸溶液。60g （5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L容址瓶中。溶液A2： 0.1M醋酸钠溶液。8.2g C2H3O2Na （或13.6g C2H3O2Na-3H2O）溶解于水中定容到1L容虽瓶PHAl体积(ml)A2体枳(ml)pHAl 体积(ml)A2体积（ml）3.6926744.84006003.88801205.02967044.08201805.2210790PHAl体枳(ml)A2体枳(ml)pHAl 体积(ml)A2体积(ml)3.0930705.23606603.28701265.43206803.4810
6、1905.62707263.67502605.82307643.87003006.01908104.06603406.21408564.26103706.4609404.45604406.6409604.65104906.8309704.84605407.0109855.0410590表4中等pH值(25C)磷酸缓冲液的配制方法溶液A1：0.1M磷酸二氢钠溶液。13.8g N3H2PO4-H2O溶于水中.定容到1L容虽瓶中。溶液A2： 0.1M磷酸氢二钠溶液c268g Na2HPO4-7H2O(或359g Na2HPO4-12H2O)溶于水中，定容到1L容虽瓶中。PHA1体积(ml)A2体积(
7、ml)pHAl 体积(ml)A2体积(ml)5.6948527.03906105.8920807.22807206.08771237.41908106.28151857.61308706.47352657.8859156.66853158.0539476.8510490表5和6给出了适于pH=7-10.6范碉的两种有机碱缓冲液配制方法，这种有机碱缓冲液可以有效低减缓硅胶基柱的柱效降低表5高pH (25t)甘氨酸缓冲溶液的配制方法溶液A1：02Mft氨酸。15.01g廿宓酸溶于水中，定容于IL容址瓶中。溶液A2：0.1M NaOH 溶液.稀释较浓的NaOH溶液。PHA1体积(ml)A2体枳(ml
8、)pHAl 体积(ml)A2体积(ml)8.6252.09.62511.28.8253.09.82513.69.0254.410.02516.09.2256.010.42519.39.4258.410.62522.7529.4g C6H5O7Na3-2H2O溶解于水中.定容到IL容虽瓶中。表6(25CTris缓冲溶液的配制方法4.24.44.67366105102643904905.45.617696824904表3溶液A1：溶液A2：不同pH值(25C)柠椽酸缓冲溶液的配制方法0.1M柠椽酸溶液c 21.0g柠檬酸溶于水中，定容到1L容虽瓶中。0.1M柠椽酸钠溶液。商pH值溶液 Al： 0.1M Tris (无碱,12.11gTris 溶于水中. 溶液A2： 0.1MHCI溶液，稀释较浓HCI溶液。定容到1L容址瓶中。PHAl体积(ml)A2体枳(ml)pHAl 体积(ml)A2体积（ml）7.15045.78.15026.27.25044.78.25022.97.35043.48.35019.97.45042.08.45017.27.55040.38.55014.77.65038.58.65012.47.75036.58.75010.37.85034.58.8508.57.95032.08.9507.0&05029.2
