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1、实验7考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸 收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、漠甲酚 绿和漠甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为 蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。25分钟即呈 最大光吸收，至少稳定1小时。在0.011.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅
2、速， 消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿 素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液 pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英 怀测定。三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加 水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在1030mg/ml（二）器具1、试管及试管
3、架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（一）标准曲线的制作1、取7支试管，按下表加入试剂-一试管编号试剂(ml)-01234561mg/ml牛血清蛋白00.10.20.40.60.81蒸馏水10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂55555552、将试管摇匀，放置20分钟。3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。（二）样品的测定1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.2、将试管摇匀，放置20分钟。3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。五、注意事项1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料 增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不 致影响测定2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染 料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。六、实验报告绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。七、思考题1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么？2、考马斯亮蓝法有什么优缺点？
