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1、一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性的人细胞因子趋化素样因子 1 的克隆和特性研究韩文玲 娄雅欣 唐军民 张颖妹 陈英玉 马大龙 等细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。 近年来， 越来越多的细胞因子得以发现。 本文介绍一种新的细胞因子趋化素样因子1（CKLF1）的发现和特性研究。 CKLF1全长 cDNA序列包括 530 个碱基，有一个编码 99 个氨基酸的完整开放读码框架。 CKLF1与已发现的其它细胞因子没有明显的序列同源 性。CKLF1在 PHA刺激的 U937细胞中的表达可被 IL-10 所部分抑制。重组的 CKLF1能够明显趋化嗜中性细 胞、单核细胞和淋巴细胞，同时，
2、它能够刺激小鼠骨骼肌细胞的增殖。以上结果表明 CKLF1 可能在炎症和 骨骼肌再生过程中发挥重要作用。关键词：白细胞介素 10；骨骼肌细胞；剪切；抑制性减数杂交前言 细胞因子是一群在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。总的来说，细胞因子在细胞被活化 后呈一过性诱导表达，其表达受多种因素调控。细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋 化因子等 （1）。其中，趋化因子是结构相似的小分子蛋白质，在吸引和活化白细胞过程中起重要作用。趋化 因子在蛋白质水平上含有 4 个保守的半胱氨酸， 根据前两个半胱氨酸的相对位置不同， 趋化因子可分为 CXC （）、CC（）、C（）和 CX3C（）4
3、个亚家族， C代表半胱氨酸， X 代表任一氨基酸 （2）。以前的研究表明：人前单核细胞系 U937 细胞在 PHA 刺激下，能够产生多种细胞因子；而白细胞介素10 能抑制多种细胞因子的产生 （3）（4）。基于以上研究结果， 我们设计了一条新的技术路线来发现新的细胞因 子。利用抑制性减数杂交技术，从 PHA刺激的 U937 细胞中克隆到能被 IL-10 所抑制的 cDNA序列，其中一 个序列编码一个新的分泌性细胞因子，含有CC家族趋化因子所具有的特征性结构即两个连续的半胱氨酸，并对多种白细胞具有趋化作用，该因子被命名为趋化素样因子1（ CKLF1）。但是，该因子与其它 CC家族趋化因子有如下区别
4、： （ 1）CKLF1成熟蛋白质只有一个连续的 CC结构，其羧基端没有其它的半胱氨酸； （ 2） CKLF1与已发现的其它 CC家族趋化因子没有明显序列上的同源性；（ 3）CKLF1至少存在其它三种不同的RNA剪切形式；（ 4）它对骨骼肌细胞有刺激作用。 CKLF1可能代表一个新的家族的趋化因子。因此，我们将 其命名为趋化素样因子 1，其相应的变异体命名为 CKLF2，CKLF3和 CKLF4。材料和方法抑制性减数杂交（ SSH）SSH 的操作方法按 Diatchenko 报道的进行操作(5)用 CLONTECH公司的 PCR-Select TM cDNASubtraction Kit 。 S
5、SH技术把抑制性 PCR(Suppression PCR)和传统的减数杂交方法相结合 (16) ，可用于比较 两个群体的 mRNA，得到在一组 mRNA中表达，而在另一组 mRNA中低表达或不表达的基因。先将mRNA反转录为 cDNA，其中含有特异表达基因的样本为 tester ，另一组为 driver ， tester 和 driver cDNA 杂交，去 除杂交体 cDNA，没有形成杂交体的 cDNA即是在 tester 中特异表达或高表达的基因，而在 driver 中不表 达或低表达的基因。抑制性 PCR在选择性扩增特异基因的同时，抑制自身的扩增，使杂交阳性率更高。在 SSH操作过程中，
6、人前单核细胞系 U937 细胞由本室长期传代培养。细胞培养在含10%胎牛血清 ，100U/ml青链霉素的 RPMI1640培养基中。用于 SSH操作的 U937 细胞批量培养至 2107细胞，离心收集细胞 , 用 Hanks液洗三遍后悬于含 10ng/mlPHA 的 10% FCS RPMI1640中, 其中一半即 1107 细胞作为 tester, 另 一半细胞中加入终浓度为 100ng/ml 的 IL-10 作为 driver 。继续培养 8 小时后收集细胞， 提取 mRNA，取 2 gmRNA合成双链 cDNA，用 RsaI 切后，将 tester 分为两组，在 T4 DNA连接酶作用下
7、，分别连上 Adapter1 和 Adapter2 ，进行两轮杂交，杂交产物用作 PCR 扩增的模板。将杂交产物稀释 1000 倍，利用试剂盒提供 的 PCR引物，进行第一轮 PCR，扩增 27 轮，然后将第一轮 PCR产物稀释 10 倍，分别以 NESTED PCR引物 1 和 NESTED PCR引物 2R 进行第二轮 PCR，扩增 15 轮，得到的扩增产物即为差异基因片段， Glassmilk 回收 2001600bp 的片段，克隆到 pGEM-T easy 中，连接产物转化 XL-Blue 菌，选白色克隆。得到约 100 个克 隆，随机筛选 15 个变大明显的克隆，纯化质粒 DNA，用
8、 ALF 快速测序仪进行序列分析，并在NCBI中进行序列同源性比较。生物信息学将来自 PHA刺激的 U937 细胞文库的 EST片段与 GenBank TBLASTN的 EST数据库进行比较。将与 CKLF1 片段有高度同源性的序列(50 个以上碱基，95%以上同源性)，通过 EST Assembly Machine (http:/www.tigem.it). 进行 EST拼接( 6)。用于 CKLF1拼接的 EST 片段的登记号为 W38899, N95062, AA429945, AA987264, AA927461, W19056, N89912, AA516431, AA479657,
9、 AA455042, AA989129, AF151058， NM-016951，W52820。在 PHA刺激的 U937 细胞中得到 CKLF1的全长序列，测序证明 EST 拼接正确。 CKLF1 可 能 的 信 号 肽 切 割 位 点 分 析 用 PcGene 、 Prosite 软 件 和 Signal P server (http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 进行分析。 CKLF1 的染色体定位用HTGS 数据库分析(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)。包含 CKLF1基因的两个染色体片段的登录号为 AC010542和 AC0
10、18557。Northern Blot 分析我们对目的基因的表达情况进行了 Northern Blot 分析，细胞总 RNA的提取用生命公司的 TRIZ0LTM试剂提取。分别取 20 g tester 或 driver RNA ，在 1.5%的甲醛变性胶中电泳，通过毛细管吸引法将RNA转到尼龙膜上。探针的标记和杂交操作参照DUPONT公司 Random Primer Fluorescein Labeling kit withAntifluorescein-HRP （DuPont NENNELMGC-803）试剂盒说明书。标记探针的核苷酸均为来源于SSH杂交得到的全长 EST片段（ CKLF1全
11、长 cDNA片段中的 53-530 位碱基）。寡核苷酸用于扩增 CKLF1及其变异体的全长 cDNA片段的引物为： P1 5 GCA, AGA, AGC,GGG, AAG, CCG, A 3和 P2 5 GGA, AGA, ATA, CAG, AAA, TAT, GTT, TAA, TAC 3； 用于扩增 CKLF1及其变异体的编码区 cDNA片段以构建 pCDI-CKLF1的引物为： P3 5 ATG, GAT, AAC, GTG, CAG, CCG, AAA, AT 3 和 P4 5 TTA, CAA, AAC, TTC, TTT, TTT, TTC, ATG, C3； 用于扩增不含终止密
12、码的 CKLF1及其变异体的 cDNA片段，以构建 pEGFP-N1-CKLF1,p EGFP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4的下游引物为： P5 5 CGG GATC CA AAA CTT CTT TTT TTT CAT GC 3CKLF1表达谱分析用巢式 PCR的方法对 CKLF1 及其变异体在各种不同组织中的表达水平进行分析，用Clontech 公司Multiple Tissue cDNAP anels 试剂盒提供的单链 cDNA文库作模板，利用 P1，P2 和 P3，P4 引物，进行 PCR 扩增。在第一轮 PCR反应中，取 1lcDNA文库作模板，反应体系为 25
13、l ，进行 25个循环；在第二轮 PCR 反应中，取 1l 第一轮 PCR产物作模板，反应体系为 25l ，进行 20 个循环。取 10l 第二轮 PCR产物，在 5%SDS-PAG胶E 中电泳。质粒构建为了对 CKLF1， CKLF2 和 CKLF4 的亚细胞定位进行研究，将去终止码的相应序列克隆到表达载体 pEGFP-N1中。用 P3和P5引物，从PHA刺激的 U937细胞 cDNA文库中，扩增 CKLF1，CKLF2和CKLF4的cDNA 序列，在 P5 引物中，终止码被去除，并引入 BamH1酶切位点。 PCR产物用 Klenow 酶处理为平端，然后用 BamH1酶切。 pEGFP-N
14、1载体先用 EcoRI 酶切，再用 Klenow 酶处理为平端，然后用 BamH1酶切。酶切处理后 的载体片段和 目的基因片 段 回收后，连接 得到重组 质粒 pEGFP-N1-CKLF1， pEGFP-N1-CKLF2和 pEGFP-N1-CKLF。4 用 P3和 P4引物从 PHA刺激的 U937 细胞 cDNA文库中，扩增 CKLF1的 ORF片段，克隆入 pGEM-T载体中，测序。用 EcoRI 将插入片段释放出来，连接至经 EcoRI 切后，并用 CIP 处理后的 pcDI 载 体中，经酶切鉴定可得到 CKLF-1 的正义表达载体 pcDI-CKLF1。pcDI 是将 pcDNA3的
15、 BglI-kpnI 片段与 pCI 的 BglI-KpnI 片段置换后得到的一个真核表达载体 （ 7）。转染和转染试剂在瞬时转染中， COS-7 细胞在 10%胎牛血清的 DMEM中培养。用 SuperFect 转染试剂，根据说明转染COS-7细胞。 48 小时后，收集转染上清，用于活性分析和Western blot 分析。细胞用 PBS 洗，甲醛固定30 分钟，再用 PBS洗，荧光显微镜观察。CKLF1-EGF，P CKLF2-EGFP， CKLF3-EGFP在 COS-7细胞上清中的 Western blot 分析将 pEGFP-N1， pEGFP-N1-CKLF1, pEG FP-N1
16、-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4四种质粒分别转染 COS-7细胞，48 小时后，各取 70l 细胞上清，进行 SDS-PAGE电泳，电转至尼龙膜上，与抗 EGFP多克隆抗体反应，再 与 HRP标记的二抗反应，用化学发光的方法进行检测。趋化实验按照以前报道的方法 （ 8），从健康成年志愿者外周血中分离嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。纯化 的嗜中性粒细胞重悬于 HBSS缓冲液中，细胞密度为 1X106/ml ；淋巴细胞和单核细胞重悬于含 0.5%低内毒 素 BSA和 20mM Hepes的 1640 培养液中，细胞密度分别为 5X106/ml 和 2X106/ml 。细胞趋化实验用 48 孔趋 化小室，按照文献报道的进行 （9）。小孔的下面装满 COS-7 细胞的转染上清，上面是各种不同类型
