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1、实验一鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(5009.9-2003食品中淀粉的测定)一、目的与要求：1、了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求。2、掌握回复突变的测试方法。二、实验原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组 氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存 在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据 此判断受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱 导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。三、培养基和试剂1、0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分：L-组氨酸(MW155)78mgD-
2、生物素(MW244)122mg加蒸馏水至1000ml配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压 灭菌20min。贮于4C冰箱。2、顶层琼脂培养基成分：琼脂粉1.2g氯化钠1.0g200ml加蒸馏水至配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时，加入0.5mmol/L组氨酸一0.5mmol/L生物素溶液20mL。碘溶液：称取3.6克碘化钾溶于20毫升水中，加入1.3克碘，溶解后加水稀释至100毫升。3、Vogel-Bonner (V-B)培养基 E成分：枸椽酸(C6H8O7-H2O)100g磷酸氢二钾(K2HPO4)500g磷酸氢铵钠(NaNH4HP
3、O4 - 4H2O)175g硫酸镁(MgSO4 7H2O)10g加蒸馏水至1000ml配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容 量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4C 冰箱。4、20%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加蒸馏水至1000ml配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4C冰箱。5、底层琼脂培养基成分：琼脂粉7.5g蒸馏水480mlV-B培养基E10ml20%葡萄糖溶液10ml配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀
4、倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固 化后倒置于37C培养箱中24h，备用。6、营养肉汤培养基成分：牛肉膏2.5g胰月东5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g加蒸馏水至500mL配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于 4 C冰箱。7、盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)成分：氯化钾(KCl)61.5g氯化镁(MgCl2 - 6H2O)40.7g加蒸馏水至500ml配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。 储于4C冰箱。8、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4
5、- 2H2O)2.965g磷酸氢二钠(Na2HPO4 - 12H2O)29.015g加蒸馏水至500ml配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4C 冰箱。9、S9混合液成分：每毫升S9混合液肝S9100皿盐溶液20以灭菌蒸馏水380皿0.2mol/L磷酸盐缓冲液500以辅酶 II(NADP)4mol6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mol配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按 上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该 混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。实验结束，剩余S9混合液 应该丢弃。10、大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制
6、备诱导：最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯(PCB混 合物)，选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂 量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。苯巴比 妥钠和8 -萘黄酮结合也可做为诱导剂。S9制备：动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可 自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下， 取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗 肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.1 5mol/L氯化钾溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心 机上
7、，在4C条件下，以9000g离心10min，取其上清液(S9)分装于 塑料管中。每管装2 mL 3 mL。储存于液氮生物容器中或-80C冰箱中 备用。上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一 切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱 变剂进行鉴定。11、溶剂的选择如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应 选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜 (DMSO)、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响， 常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100皿。12、剂量的设计决定受试物最高剂量
8、的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变 数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒 性的标志。对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿。对产品而言，有杀菌作 用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高 剂量可为原液。受试物至少应设四个剂量组。每个剂量均做三个平行平 板。四、操作方法1、增菌培养取营养肉汤培养基5ml，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的 菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37C振荡（100次/min）培养10 h。该菌株培养物应每毫升不少于12X109活菌数。2、平板掺入法实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶
9、液的顶层琼脂 培养基2.0mL分装于试管中，45C水浴中保温，然后每管依次加入试验 菌株增菌液0.1mL，受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL （需代谢活化 时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。 水平放置待冷凝固化后，倒置于37C培养箱里孵育48h。记数每皿回变 菌落数。实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、 阳性诱变剂对照和无菌对照。五、数据处理和结果判断记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性 诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以 上，并呈剂量-反应
10、关系者，则该受试物判定为致突变阳性。受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或 未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如 果受试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受 试物为致突变阴性。六、试验报告试验报告应包括以下内容：（1）受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂；（2）试验菌株：所用试验菌株；（3）代谢活化系统：所用诱导剂；（4）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶 剂对照和阳性对照，阳性结果判定标准；（5）结果：以列表方式报告受试物的Ames实验结果（表1）；（6）结论。表1 Ames试验菌株的回变结果（平均值土标准差）剂量 TA97TA98TA100TA102组别 (mg/-( S9)+( S9)-(S9)+( S9)-( S9)+( S9)-(S9)+(S9)皿)受试物自发回变溶剂对照阳性物对照
