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1、本科学生实验报告学号 000000000 姓名 xxx 学院 生命科学学院 专业、班级 11级生物科学C班 实验课程名称 细胞生物学实验 指导教师及职称 吴暇玉 开课时间 2013 至 2014 学年 第一 学期填报时间 2013 年 12 月 1 日云南师范大学教务处编印实验名称：人宫颈癌HeLa细胞的培养实验时间：星期二 上午三、四节课小组合作：是一、实验预习1、 实验目的（1) 能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒；掌握湿热灭菌法的操作； (2)自学各类仪器用具清洗及各种消毒方法； (3)熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法； (4)熟练掌握细胞传代培养的操作方法； (5
2、)观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况； (6)掌握死活细胞的鉴别原理及方法。2、 实验设备及材料（一）仪器超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、光学显微镜、细胞培养瓶、250ml和125ml试剂瓶、量筒、研钵、离心管、血球计数板、滴管（二）材料紫外灯、微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um、HeLa细胞株、pH试纸(三）试剂70%或75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl、蒸馏水、0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制）等3、 实验原理及实验流程或装置示意图：（1）清洗与消毒是组织培养实验的
3、第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。（2）体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。（3）灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。（4）组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是
4、它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。（5）传代培养(subculture):培养细胞的生存环境是瓶皿或其他容器，生存空间和营养是有限的，当细胞增殖到一定密度后，需要分离出一部分细胞并更新营养液，这一过程称为传代。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。（6）悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养
5、的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大（7）悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。（8）细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。其原理是：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。 4、 实验方法步骤及注意事项：洗液的配制
6、：成分强酸洗液次强酸洗液重铬酸钾6.3g12g浓硫酸1 00ml20ml蒸馏水20ml1 00ml配制方法：1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在磁力搅拌器上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。 2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。塑料制品的清洗： 1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍 2）强（次强）酸洗液浸泡26h. 3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次 4）浸泡在70%乙醇0.51h,备用。 5）用前从乙醇中取出，在超级工作台内紫外线照射1h。配制100ml RPMI 1640培养液：1）每组称取RPMI 1640干粉 1.04g，溶于10
7、0ml的3DW。2)置于搅拌器上搅拌40分钟，直到液体变为澄清为止。3)加入0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。4)配制好的培养基，用时用饱和 NaHCO3液调节PH至6.8-7.0。5)溶好以后的培养液在超净台中进行0.22um滤过除菌，分装至试剂瓶中。6)瓶口封好，-20或4 贮存。RPMI 1640生长培养基的配制50毫升储备液浓度终浓度RPMI 1640培养液44.5谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清510%HeLa细胞的传代培养：1)选取拟作传代培养的样本，取0.5mL细胞悬浮液加入
8、等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。如果样本成活率高，无污染即可用于传代。用弯头吸管将原代培养瓶内的细胞吹打均匀，注意将那些半贴壁生长的细胞吹打脱离以免在移换容器时丢失。2)把细胞悬液吸入无菌离心管中，塞紧反口橡皮塞以防止空气污染，用1000r/min离心5min。吸去上清夜，加入适量的培养液，用吸管打匀制成细胞悬液。3)重复步骤1，计算细胞数，加入适量培养液把最终细胞数调节至11053105个/mL。4)把细胞悬浮分装至新备的细胞培养瓶中，置于37二氧化碳培养箱中继续培养。死活细胞的鉴别与计数：1）取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放
9、置1min。2)取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。3)低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧活下方。计数公式：每毫升原液细胞数=4大格细胞总数/4 10000 稀释倍数细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数二、实验内容1、 实验现象、数据及观察结果：（1）实验现象：培养瓶内培养液变浑浊,细胞不贴壁，漂浮着，细胞死亡。（2）实验数据：在计数板中的
10、死活细胞数死细胞数活细胞数左上方25左下方21右上方11右下方02合计592、 对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论：（1）实验现象：培养瓶内培养液变浑浊,细胞不贴壁，漂浮着，细胞死亡。（2）实验结果：每毫升原液细胞数=14/4 10000 2=70000细胞存活率（%）=（14-5）/14 100%=64.3% 3、 结论： 本次试验我们小组的细胞没有存活下来，可能是因为细胞培养时间太长，营养成分不够，导致细胞没有贴壁，漂浮起来，或者将细胞注入培养液中培养的时候没有混匀从而导致细胞死亡。本次试验的后期步骤只能用老师提供的实验材料完成，在显微镜下仔细观察可以发现活细胞是透明的，而死细胞是被染
11、成了蓝色。然后，在细胞计数板上数出死活细胞数。三、实验总结优点： 1、本次实验练习了实验的操作技巧及熟练程度并且需要发挥了小组成员之间的团结协作精神，分工合作协调；2、掌握了相关的原理和在生物学上的意义以及相关试剂的作用，同时也加强了分子生物学实验方面的基本方法技，熟练了实验过程中的操作技术。缺点： 1、由于培养的时间和接种或者操作有误等问题，导致实验中细胞都没有存活下来了； 2、实践机会较少，基本操作不够熟练，甚至错误； 3、没有预习，导致实验过程中由于不知道药品作用和性质与需要资料一一对照。改进措施：1、在以后的实验过程中我们应该把仪器清洗干净，避免实验出现错误； 2、在仅有的几次试验中我们应该多把握操作机会，在其他同学操作的时候，自己观察操作步骤及技巧，保证操作的准确性； 3、在今后的实验中，我们应该培养预习的习惯，这有利于实验的有序进行。四、指导老师评语及得分： 签名： 年 月 日
