卵磷脂酶实验计划

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1、卵磷脂酶高产菌株的筛选（试验计划）2014 级制药工程 2 班靳羽 222014329052003全修锐 22014329052011实验背景 ：卵磷脂酶，卵磷脂酶，又称为a毒素它因能水解卵磷脂， 可以水解各种组织的细胞，尤其是红细胞，它是一些细菌如 Closridium perfringens 所产的毒素的主要成分，蛇毒的毒性也是由它引起的。广 泛分布于胰脏、小肠、大麦，点青霉、草分枝杆菌中，并已从后两种微 生物中提纯。因多半结合在细胞内颗粒上，所以提纯困难。某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂， 生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成 不透明的

2、乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物等 阴性菌后进行划线分离得到枯草芽孢杆菌，将其接种到卵黄培养基上进 行培养，根据卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环 做初筛。本实验主要包括：卵磷脂酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌 种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、卵磷脂酶产生菌的生长 及生长曲线绘制、培养基优化。1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品（取土壤表层 5-10cm 下的肥土 100g 左右，把采 得的土壤放入纸袋带回实验室分离）1.2 实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基；卵黄培养基（用于菌种鉴定

3、）；显微镜、恒 温水浴锅、酒精灯、接种针、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试 管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭 菌锅、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴 管、分光光度计等。2 实验方法与步骤2.1 培养基的配制方法1. 称量 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。2. 溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀， 然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需 的总体积。3.调 pH4.分装 按实验要求将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶 内。5包扎 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号 笔注

4、明培养基名称、组别、日期。6灭菌 将上述培养基以 1.02kg/cm2（15 磅/英寸 2），1213 C,15-20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。7制作平板将灭菌后的培养基冷凝至 5560C ,放在超净台上，点燃酒精灯， 右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左 手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，以铺满皿底为度。8无菌检查待培养基凝固后， 5 个培养皿一叠，倒置平放在恒温培养箱中培养2448 小时，以检查灭菌是否彻底。2.2 卵磷脂酶产生菌的分离1）采集土壤样品，用无菌水制备 1：10； 1:100； 1:1000 土壤

5、悬液 3组；2）分别取三组土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入80C水浴中热处理20min,以杀死非芽抱细菌;3）取加热处理过的土壤悬液100-200卩L,涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32C培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌 落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌（菌体应呈 杆状，具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）。2.3 卵磷脂酶产生菌的筛选从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔A 法：将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上， 361 C培养36h,观察结果。B

6、法：先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于36C待干后，将待检菌接种 于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半， 36 土 1C培养2448h，观察结果。判定方法：在未涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较大的不透明乳白色 混浊区，在涂抗血清的一半平板上，菌落周围无不透明混浊区，为阳 性。 两边均无不透明区，为阴性。（卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否 产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制）2.4 卵磷脂酶产生菌的发酵与酶活力测定2.4.1 卵磷脂酶产生菌的发酵（1）将保藏培养基中的产卵磷脂酶的枯草芽孢杆菌接种两环到种 子培养液中，30-32C摇床发酵培养16

7、h,4C冰箱保存。（2）取 10ml 含产卵磷脂酶的枯草芽孢杆菌的种子培养液接入含 100ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，30-32C摇床发酵培养，作为 样一。(3) 样一培养 12h 后，再取 10ml 含产卵磷脂酶的枯草芽孢杆菌 的种子培养液接入含 100ml 液体发酵培养基的 250ml 三角瓶中， 30-32C摇床发酵培养，作为样二。(4) 在发酵培养的48h内，每3h取一次样，每次取5ml,放入10ml 的离心管中，于4C冰箱冷藏。(5) 48h后将所有取样3000rpm离心10min,离心所得上清液680nm 进行酶活力测定，每管沉淀加5ml蒸馏水600nm测生长曲线。2.

8、4.2 卵磷脂酶酶活力的测定1) 配制液体培养基于250mL摇瓶中，做6个摇瓶，将三个土壤初筛分 离纯化的菌种分别各接入两个摇瓶中，在35C，220rpm振摇条件下培 养24h，观察。2) 测酶活力(1)NPPC 法磷脂酶C能水解NPPC(p-nitrophenylphoryleholine)底物生成磷酸胆 碱和对硝基苯酚，后者是一种黄色物质，在410nm下有光吸收，通过 测定酶催化反应生成的黄色对硝基苯酚的量来计算酶活。2ml 的 10mmol/Lp-NPPC,20mmol/LCaCl2，20mmol/LMnCl2，pH7.2 的 50mmol/LTris-HCl 溶液，体积分数为 0.5%

9、的甘油和磷脂酶C的混合物反应体系，37C下水浴30min，然后于410nm下测 光吸收值。酶活力单位(U)的定义：将37C下磷脂酶C每分钟水解NPPC 生成 1.0nmol 的对硝基苯酚定义为 1 个酶活力单位。(2)滴定法利用磷脂酶水解卵黄液中的卵磷脂释放出酸性水解产物一磷酸胆碱可 与反应的特点,利用自动电位滴定仪使反应系统保持一定的值,通过测 定一定条件和一定时间内酶反应所消耗的的量来计算酶活力。酶活力单 位定义通常指C条件下每分钟释放出lumol的H+所需的酶量。2.5 培养基优化（正交实验）1）确定试验因素和水平数根据试验的目的确定试验要研究的因素。据资料查阅，常用的卵黄琼脂 培养基为

10、：牛肉膏0.5%，蛋白胨 1.5%，氯化钠 0.5%，葡萄糖1%。将其 定为基础培养基，并以它确定了四个因素，每个因素各三个水平，如下 表所示:4因素3水平表因素水平牛肉膏（）蛋白胨（）氯化钠（）葡萄糖（）ABCD10.31.00.30.520.51.50.5130.72.00.71.52）选用合适的正交表根据试验因素和水平数的多少以及是否存在相互作用来选择合适的正 交表。如下表所示：L9（34）的正交表列号实验号A（牛肉膏）1因素B （蛋白胨）2因素C （氯化钠）3因素D （葡萄糖）4因素11(0.3%)1 (1.0%)1(0.3%)1(0.5%)21(0.3%)2(1.5%)2(0.5%)

11、2 (1.0%)31(0.3%)3(2.0%)3(0.7%)3(1.5%)42(0.5%)1 (1.0%)2(0.5%)3(1.5%)52(0.5g)2(1.5%)3(0.7%)1(0.5%)62(0.5%)3(2.0%)1(0.3%)2 (1.0%)73(0.7%)1 (1.0%)3(0.7%)2 (1.0%)83(0.7%)2(1.5%)1(0.3%)3(1.5%)93(0.7%)3(2.0%)2(0.5%)1(0.5%)3）根据正交表的培养基配方配制不同的培养基并灭菌4）将复筛摇瓶中产生的菌种接种到九个培养液中，摇瓶振荡发酵培养 24 小时5）测定各培养基中卵磷脂酶的活力并比较确定最优条

12、件2.6 紫外线诱变育种紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm.灯与 处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。 一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70 80%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌抱子和酵母 细胞为106107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太 深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射 均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在 红灯下进行。具体操作步骤1. 将细菌培养液以3000r / min离心5min,倾去上清液，将菌体

13、打散加 入无菌生理盐水再离心洗涤。2. 将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打 散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内， 一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108 个/ ml 左右，作为待处理菌 悬液。3. 取24mL制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌 子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先 开紫外线10min,让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10 50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。4. 取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌 细胞数。5. 取照射菌液2ml于液体培养基中（300ml三角瓶内装30ml培养液）， 120r/ min 振荡培养 46h。6. 取中间培养液稀释分离、培养。