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1、-染色体步移技术Genome Walking是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用： 1. 根据的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究构造基因的表达调控。如别离克隆启动子并对其功能进展研究； 2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列； 3. 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等； 4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列； 5. 用于人工染色体 PAC、YAC 和 BAC 的片段搭接。其
2、主要原理是根据 DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物SP Primer，与退火温度较低的兼并引物，进展热不对称 PCR 反响。现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍的很详尽，下面给你发一个原理图：大致的原理是这样的，依据TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下：1. 基因组 DNA 的获取。 基因组 DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因组 DNA例如：只进展细胞热处理或蛋白酶处理作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。此外，由于本方法灵敏度极高，模板 DNA 一定不要污染，所需的 DNA
3、 量不要少于 3 g。 2. 序列的验证。 在进展 PCR 实验之前必须对序列进展验证，以确认序列的正确性。具体方法为：根据序列设计特异性引物扩增长度最好不少于500 bp，对模板进展 PCR 扩增，然后对 PCR 产物进展测序，再与参考序列比较确认序列的正确性。 3. 特异性引物的设计。 根据验证的序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。 4. 1st PCR 反响。 基因组 DNA 经 OD 测定准确定量后，取适量作为模板不同物种的最正确反响 DNA 量并不一样，实际用量参考下面的注*1，以 AP Primer四种中的任意一种，以下以 AP1 Pr
4、imer 为例作为上游引物，SP1 Primer 为下游引物，进展 1st PCR 反响。 按以下组份配制 1st PCR反响液。 Template基因组 DNA * ng *1 dNTP Mi*ture2.5 m each 8 l 10LA PCR Buffer IIMg2+plus 5 l TaKaRa LA Taq 5 U/l 0.5 l AP1 Primer100 pmol/l 1 l SP1 Primer10 pmol/l 1 l dH2O up to 50 l 1st PCR 反响条件如下： 94 1 min 98 1 min 94 30 sec 6068*2 1 min 5 Cy
5、cles 72 24 min*3 94 30 sec； 25 3 min； 72 24 min*3 94 30 sec； 6068*2 1 min； 72 24 min*3 94 30 sec； 6068*2 1 min； 72 24 min*3 15 Cycles 94 30 sec； 44 1 min； 72 24 min*3 72 10 min5. 2nd PCR 反响。 将 1st PCR反响液稀释 11000 倍后，取 1 l作为 2nd PCR反响的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物，进展 2nd PCR反响。 按以下组份配制 2nd PCR反响
6、液。 Template1st PCR反响液 1 l *4 dNTP Mi*ture2.5 m each ) 8 l 10LA PCR Buffer IIMg2+plus 5 l TaKaRa LA Taq 5 U/l 0.5 l AP1 Primer100 pmol/l 1 l SP2 Primer10 pmol/l 1 l dH2O up to 50 l 2nd PCR 反响条件如下： 94 30 sec； 6068 1 min*2； 72 24 min*3 94 30 sec； 6068 1 min*2； 72 24 min*3 15 Cycles 94 30 sec； 44 1 min
7、； 72 24 min*3 72 10 min 6. 3rd PCR 反响。 将 2nd PCR反响液稀释 11000 倍后，取 1 l作为 3rd PCR反响的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物，进展 3rd PCR反响。 按以下组份配制 3rd PCR反响液。Template2nd PCR 反响液 1 l *4 dNTP Mi*ture2.5 m each ) 8 l 10LA PCR Buffer IIMg2+ plus 5 l TaKaRa LA Taq 5 U/l 0.5 l AP1 Primer100 pmol/l 1 l SP3 Primer10 pmol/l 1 l dH2O up to 50 l 3rd PCR 反响条件如下： 94 30 sec； 6068*2 1 min； 72 24 min*3 94 30 sec； 6068*2 1 min； 72 24 min*3 15 Cycles 94 30 sec； 44 1 min； 72 24 min*3 72 10 min 7. 取 1st，2nd，3rd PCR反响液各 5 l，使用 1的琼脂糖凝胶进展电泳。 8. 切胶回收清晰的电泳条带，以 SP3 Primer 为引物对 PCR 产物进展 DNA 测序。染色体步移的本卷须知CTAB提取DNA. z.
