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1、基因是人体最主要的抗凋亡基因。它编码的 Bcl-2 蛋白主要分布在线粒体外膜、细胞膜 内表面、内质网膜及核膜等处。广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多 种肿瘤细胞，但在肝、肾、肺中仅有微量表达。在 bcl-2 转基因小鼠可观察到细胞凋亡减少、 免疫细胞存活延长而增加患脓毒症时的生存率。体内和体外实验都表明 bcl-2 基因可抑制各 种刺激下多种细胞的凋亡。bcl-2的过度表达可防止糖皮质激素、射线等引起的造血细胞凋 亡。也可防止撤除神经生长因子或病毒感染后的神经元凋亡。Bcl-2抗凋亡的机制目前认为主要有：拮抗促凋亡基因bax: 抑制促凋亡的蛋白 质细胞色素c自线粒体释放到胞质
2、；阻止胞质中的细胞色素c激活caspase:有抗氧 化及维持细胞内钙稳态等作用。bax基因属于bcl-2基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产 生阻抑作用。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的 关键因素，因此认为， bax 是极重要的促细胞凋亡基因之一。 Bax 的表达更为广泛，它可 出现在肝细胞、肾小管上皮细胞、呼吸系上皮细胞和支气管平滑肌、血管平滑肌细胞中。我们在创伤失血性休克大鼠发现，创伤后1 h肝、肾、肺、肠组织中Bax表达显著增 强，于创伤后 3 h 达高峰，持续24 h 以上，并与组织细胞的凋亡发生率显著相关。创
3、伤前 后 Bcl-2 在肝、肺、心、肾、小肠平滑肌细胞中均未表达。我们在肠缺血再灌注损伤大鼠观 察到，肝小叶中央静脉周围的血液灌注不良区域肝细胞凋亡多， Bcl-2 表达逐渐减弱直至不 表达，而外围区表达则增强。付小兵报道，在肠缺血再灌注损伤大鼠，损伤早期细胞凋亡与 Bcl-2 表达均明显增加，随着再灌注时间延长， Bcl-2 表达增多，凋亡减少，肠黏膜结构损 伤减轻。提示内在的抗凋亡机制激活，并在减轻组织损伤中起作用。 bcl-2 基因启动子具有 NF-kB的结合位点并受其调控，故NF-kB可活化通过诱导bcl-2及其他抗凋亡基因而阻止 细胞凋亡。也可通过刺激IL-1卩转化蛋白酶、c-myc
4、和TNF-a基因表达而导致细胞凋亡细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。 在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在 成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋 亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一 条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的可将细胞内的重要蛋白降 解，引起细胞凋亡。、凋亡相关的基因和蛋白细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞
5、增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有 ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM 等。1 Caspase 家族Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3,这些蛋白酶是引起细胞凋亡 的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它 们均有以下特点:酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性;总是在天冬氨酸之后切断底物， 所以命名为caspase(cysteine aspartate-specific protease)，方便起见本文称之为凋亡酶； 都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前
6、体被切割后产生 两个活性亚基。最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因1是ICE，即：白介素-1 B转换酶(Interleukin-1 p-converting enzyme)基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故 名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物2,分为 2个亚族(subgroup)： ICE亚族和CED-3家族(图15-6)，前者参与炎症反应，后者参与 细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者(executioner或effector)，如caspase-3、6、7， 它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化(autoc
7、atalytic) 或自剪接的方式激活；另一类为启动者(initiator)，如caspase-8、9,受到信号后，能通 过自剪接而激活，然后引起 caspase 级联反应，如 caspase-8 可依次激活 caspase-3、 6、 7。细胞中还具有 caspase 的抑制因子，称为 IAPs(inhibitors of apoptosis proteins),属 于一个庞大的蛋白家族。它们能通过BIR结构域(baculovirus IAP repeats domain) 3与 caspase 结合，抑制其活性，如 XIAP。ICE subfamily13 caspase -5 casjL
8、is-4 caspase-1rcapaw-7 caspiist-3 . cuspasi1 t 图15-6： ICE家族成员A： 3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B： caspase-3的结构模型；C： caspase-3的活化过程 引自Katja C. Zimmermann等 20012. Apaf-1Apaf-1 被称为凋亡酶激活因子-1 (apoptotic protease activating factor-1 ),在线虫中的同源物为ced-4,在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用，该基因敲除后，小鼠神经细 胞过多，脑畸形发育。Apaf-1含有3个不同
9、的结构域：CARD (caspase recruitment domain)结构域，能召集caspase-9；ced-4同源结构域，能结合ATP/dATP；C端结 构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c4的结合到这一区域后，能引起Apaf-1 多聚化而激活o Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c(Apaf-2)和caspase-9 (Apaf-3)参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就 可以通过其CARD结构域召集caspase-9,形成凋亡体(apoptosome),激活caspase-3, 启动 caspa
10、se 级联反应。3Bcl-2 家族Bcl-25为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白，其功能相当于线虫中的ced-9。现已发现 至少19个同源物,它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用,能控制线粒体中细胞色素 c 等凋亡因子的释放。Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域(BH1-4),并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region ,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促 进凋亡有关的结构域。根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类(图15-7)，一类是抗 凋亡的(anti-apoptotic)，如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、M
11、cl-1 ； 一类是促进凋亡的(pro-apoptotic), 如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。虽然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜, 它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因 子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道 ，或者开启线 粒体的PT孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase，导致细胞凋亡。胞质中的促凋亡蛋白可通过不同的方式被激活，包括去磷酸化，如Bad；被caspase 加工为活性分子，如Bid；
12、从结合蛋白上释放出来，如Bim是与微管蛋白结合在一起的。DiinerizaciDhRugul撰io円Pre formationMembrane-anchorAnti*apoptoticBe 12 Bcl-XLtBcbwPro-apoptoticBax, Bakt Bok4BH3-onIyJ proapoptoticBik. 81 k, Hrk.Bim, BnipSEid, Bad图 15-7 Bcl-2 家族 引自 Katja C. Zimmermann 等 20014. FasFas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨 膜蛋白，分布于胸腺细胞，
13、激活的T和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、 睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。5. p53是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细 胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡，研究发现丧失p53 功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导的调亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱导的调亡不 敏感。6. myc在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制分 化。在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞 增殖的基因，另一
14、方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长 因子存在， Bcl-2 基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。7. ATMATM(ataxia telangiectasia-mutated gene)是与DNA损伤检验有关的一个重要基因。 最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子， 表现出对电离辐射敏感和易患癌症。正常细胞经放射处理后， DNA 损伤会激活修复机制， 如DNA不能修复则诱导细胞凋亡。ATM是DNA损伤检验点的一个重要的蛋白激酶(参见 第十三章第四节)二、Fas介导的细胞凋亡细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体(TN
15、FR)家族的跨膜蛋白，它们包括 Fas (Apo-1/CD95)、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1 和 DR5/TRAIL-R2。其配体属 于TNF家族，目前已比较清楚的是Fas介导的细胞凋亡途径。Fas具有三个富含半胱氨酸的胞外区和一个称为死亡结构域(Death domain, DD，图 15-8)的胞内区。Fas的配体FasL(Fas ligand)与Fas结合后，Fas三聚化使胞内的DD 区构象改变，然后与接头蛋白FADD(Fasassociated death domain)的DD区结合，而后 FADD 的 N 端 DED 区(death effector domain)就能与 Caspase-8 (或-10)前体蛋白结合， 形成 DISC (death-inducing signaling complex )6，引起 caspase-8、10 通过自身剪激活， 它们启动caspase的级联反应，使caspase-3、-6、-7激活，这几种Caspase可降解胞内 结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。CD95LEffectorJApOptO5i5图 15-8 F
