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1、有关物质检查方法学建立以下内容适用于有较强的紫外吸收、用常规反相色谱法可良好分离的被测物的纯度检查。以常用的C18和C8柱为例。1、溶解度考察考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。2、紫外光谱绘制考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂中的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时的检测波长。几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。3、流动相的选择 中性成分被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小
2、，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。 碱性成分向流动相中加入胺类扫尾剂。常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。高碳数离子对试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。流动相的pH一般为35。 酸性成分向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。适用于分离3WW的弱酸。加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。流动相的一般为。4流动相的要求被测物之间分离良好，分
3、离度达到1。以5上。主成分保留时间以10分钟为宜。分析时间通常为主成分保留时间的23倍。分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。5、检测波长的再确定以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。有检测器的，考察主成分峰纯度，应达到以上。综合以上考察结果，将检测波长作修正。6供试品溶液浓度的选择配制一系列不同浓度的溶液，在不过载的前提下确定浓度的增加不再引起杂质增加的拐点浓度。配制已知原料、中间体、杂质等的稀溶液，确定其检测限与定量限。通常以0.1计%，反推得供试品溶液的最低浓度。综合以上考察结果，以柱效最优作考量，确定供试品溶液的浓度。7、方法学验证 准确度对于有定量要求的杂质要通过回收率试验验证
4、方法的准确度。例如某杂质的限度为0.2%，可分别配制该杂质浓度为0.1、0.2和0.3的杂质溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。 线性适用与有定量要求的杂质检查。在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）,进行线性回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990,Y轴截距应在
5、100%响应值的25%以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。 精密度适用与有定量要求的杂质检查。重复性配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。中间精密度配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。 专属性空白对照应无干扰，主成分峰或需定量的杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。强制降解试验考察主成分在酸、碱、高温、强光、氧化等因素影响下的稳定性。对固体状态的被测物而言，一般还需
6、分别考察在固体和溶液状态下的稳定性。要求降解产物与主成分或需定量的杂质峰完全分离。酸降解试验一般选择的盐酸，在室温或加热条件下进行考察。碱降解试验一般选择的氢氧化钠溶液，在室温或加热条件下进行考察。高温降解试验分别在固体和溶液状态下进行考察，可分别在00考察天，或在C考察小时。光降解试验分别在固体和溶液状态下进行考察，例如，可先经一百二十万勒克斯（）X小时的冷白荧光灯照射，再经瓦小时平方米的紫外荧光灯照射。氧化降解试验主要在溶液状态下进行考察，氧化剂可采用不同浓度的双氧水，分别在室温或加热条件下进行考察。同时须进行双氧水的空白试验。 检测限与定量限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。杂质峰
7、与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。 耐用性分别考察流动相比例变化5%、流动相pH值变化土0.2、柱温变化5C、检测波长变化5nm、流速相对值变化土20%以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%,杂质含量的绝对值在0.1以内。 系统适应性适用与有定量要求的杂质检查。配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0，%保留时间的相对标准差应不大于1.0。%另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.，0理论塔板数应符合质量标准的规定。 溶液稳定性按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（t）中，在123和天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0，%杂质含量的绝对值在0.1以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。根据统计数据确定供试品溶液的保存条件及效期。
