基因敲除技术

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1、基因敲除技术研究进展综述摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域，如建立 人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。这些疾 病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究：研究发育过程中各个 基因的功能，研究治疗人类遗传性疾病的途径。关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型1 .概述：基因敲除又称为基因打靶，是指从分子水平上将一个基因去除或替代，然 后从整体观察实验动物，推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的 重要研究工具。是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原

2、理，用设计的同源片段替 代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源 重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA， 它们同样可以达到基因敲除的目的。基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿，并已对生物学 和医学的许多研究领域产生深刻的影响，成为革命性的研究工具，具有极其重 要的理论意义和实践意义。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进 展的三位科学家，70岁的美国人马里奥卡佩奇(Mario Capecchi)、82岁的美 国人奥利弗史密西斯(Oliver Smithies)和66岁的英国人马丁埃文斯(

3、Martin Evans)分享了 2007年诺贝尔生理学或医学奖。2. 基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和 区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。 Tsien等于1996年在Cell首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物， 被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在 哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。2000年Shimizu等于Science报道了以时间可调性和区域特异性为标志的 第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱

4、导Cre 的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生 后不久即死亡等现象的出现。2004年该实验室Cui等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白 质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定 蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依 赖性，达到空前的时间精度，成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的 工具之一。然而，长期以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细 胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能。但我们知道，大鼠、家兔、 猪以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大

5、动物更有益于某些繁琐的 手术操作，同时血浆及组织样本量较多，更有益于研究。3. 基因敲出的一般步骤：利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：a. ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是12 9及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是 基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最 近来自于C57BL/6XCBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。 c57BL / 6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多 成功的转基因模型。b. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片

6、段同源的DNA分子 都重组到带有标记基因（如neo基因，TK基因等）的载体上，此重组载体即为打 靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体 和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况 下应设计的插入型载体要包括外源基因（即目的基因）、同源基因片段及标记基因 等部分。如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。c. 将基因打靶载体通过一定的方式（常用电穿孔法）导入同源的胚胎干细胞 （ES cell）中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重

7、组，将打 靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。一般地，显微注射命中 率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。d. 用选择性培养基筛选已击中的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比 如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK 正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚 中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。e. 通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小 鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。2. 实现基因敲除的不同原理和方法：2. 1

8、.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在， 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用 方法。2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：a. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分 子都重组到带有标记基因（如neo基因，TK基因等）的载体上，

9、成为重组载体。 基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。b. ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠， 而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是129及其杂合体， 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实 验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。C.同源重组：将重组载体通过一定的方式（电穿孔法或显微注射）导入同源 的胚胎干细胞（ES cell）中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同 源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地， 显微注射命中率较高，

10、但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使 用。d. 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动 物的重组概率为10-210-5，植物的概率为10-410 5。因此如何从众多细胞中 筛出真正发生了同源重组的胚胎十细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。e. 表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因 变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。f. 得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中， 所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，

11、需要进行至少两代遗传。2.1.2同源重组实现基因敲除的新进展：2.1.2.1条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的 细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基 因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修 饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围 和时间处于一种可控状态。条件性敲除的原理：利用Cre / LoxP和来自酵母的FLPfrt系统可以研究特定组织器官或特 定细胞中靶基因灭活所导致的表型7。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上 装上两个同向排列的1oxP，并以此

12、两侧装接上loxP的（“loxPfloxed” ）ES细 胞产生loxPfloxed小鼠，然后，通过将loxPfloxed小鼠与Cre转基因鼠 杂交（也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶），产生靶基因发生特定方式（如 特定的组织特异性）修饰的条件性突变小鼠。在“ loxPfloxed ”小鼠，虽然靶基 因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed” 小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中 将同时带有“loxPfloxed”靶基因和Cre基因。Cre基因表达产生的Cre重组 酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，

13、结果将一个loxP和靶基因切 除。这样，靶基因的修饰（切除）是以Cre的表达为前提的。Cre的表达特性决 定了靶基因的修饰（切除）持性：即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修 饰（切除）就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织 细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现 对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。2.1.2.2诱导性基因敲除法诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的 启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时 间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将

14、该表达系 统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段 和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可 以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进 行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型； 腺病毒介导型。诱导性基因敲除优点： 诱导基因突变的时间可人为控制； 可避免因基因突变而致死胎的问题 在2个loxP位点之间的重组率较高； 如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可 省去建立携带Cre的转基因动物的过程。2.2

15、利用随机插入突变进行基因敲除。2.2.1原理：此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细 胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过 相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选 择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌 介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。插入了靶目标的基因转录翻译出无活性的目标蛋白随机插入内含子中需要 敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白2.2.2基因捕获法基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法， 其原理可见图6。通常基

16、因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo 基因，neo基因插入到、细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实 现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来，从理论上 讲，在选择培养基中存活的克隆应该100%地含有中靶基因。中靶基因的信息可 以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得2.2.3基因捕获法的优缺点用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶 位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特 异性的基因敲除载体以及筛选中靶ES细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的 获得需要一年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的 遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。因此，基因捕获法应运而生， 利用基因捕获可以建立一个携带随机插