质粒提取与纯化

《质粒提取与纯化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒提取与纯化（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、分子生物学试题(质粒提取与纯化；SSCP部分)一、填空I. 质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法，包括：非离子型或离子型去圬 剂，有机溶剂,碱或加热处理。2用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到0.8 X 109细胞/ml时，即可通过 离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以8000r/min为宜。3在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：可以扩增 质粒DNA；抑制了菌体的数量，有利于裂解。4. 常使用的质粒纯化方法都利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状两 个性质。5. 由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁 移率也不同，超螺旋的共价闭合环状结构

2、的质粒DNA (SC)的泳动速度 最快，一条链断裂的开环状质粒DNA (OC)泳动速度最慢，二条链断裂 的线性DNA (L)居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的 DNA分别开来。6. 超离心法纯化质粒DNA时，选用CsCl作介质的优点是：CsCl与不同 DNA起反应;CsCl可以自动形成密度梯度，从而使不同分子量的DNA 分子得以分开。7. SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：溶解膜蛋 白及脂肪，从而使细胞膜破裂;溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来;对RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能够与蛋白质结 合形成RfO-SO3-R2+-蛋白质复

3、合物，使蛋白质变性沉淀。8碱裂解法所用溶液I、II、III的体积比为：2:4:39. 质粒提取中溶液II的主要成分为SDS和NaOH。10. 溶液III中钾是3mol/L，乙酸根是5mol/LII. LiCl可沉淀大量蛋白质和高分子RNA。12. 1OD260=50gg 质粒 DNA/ml。13. 在碱变形法提取质粒DNA实验中，聚乙二醇用于沉淀质粒DNA。14. 残留在DNA样品中的酚可抑制酶的活性。15. 质粒DNA提取中酚的pH值范围是pH7.8pH8.0o16. 乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有：乙酸铵、氯化钠和乙酸钠。17. SSCP电泳方式为非变性聚丙烯酰胺凝胶电

4、泳。18. SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳 分离的。19. 影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。20. SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是：甲酰胺21. 点突变对 SSCP 检出率的影响不仅仅取决于该点在 DNA 链上的位 置，更取决于该位置对维持立体构象作用的大小。二、选择1 质粒提取中溶液II的主要成分为：BA. SDS 和 EDTAB. SDS 和 NaOHC. EDTA 和 NaOHD. SDS 和冰乙酸2分离质粒DNA时，用蔗糖的目的是：BA. 抑制核酸酶的活性B. 保护DNA，防止断裂C. 加速蛋白质变性D. 有利于细胞破碎3. 关

5、于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确？： DA. 溶液I的作用是悬浮菌体B. 溶液II的作用是使DNA变性C. 溶液III的作用是使DNA复性D. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性4. 质粒DNA提取中酚的pH值范围：DA. pH6.5pH7.0B. pH8.0pH8.5C. pH6.8pH7.0D. Ph7.8pH8.05. CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是：CA. 氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去B. 氯化铯可以较多地插入到 SC DNA 中去C. EB可以较多地插入到线状DNA中去D. EB可以较多地插入到SC DNA中去6同一种质粒DN

6、A,以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是:BA. OC DNASC DNAL DNAB. SC DNAL DNAOC DNAC. L DNAOC DNA.SC DNAD. SC DNAOC DNAL DNA7. 用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：CA. 染色体 DNA 断成了碎片B. 染色体DNA分子量大，而不能释放C. 染色体变性后来不及复性D. 染色体未同蛋白质分开而沉淀8. 10D26o相当于每毫升质粒DNA： AA. 50gB. 100gC. 50ngD. 100ng9. 加入溶液III后出现的白色絮状沉淀不包括：AA. 质粒DNA和小分子量RNA

7、B. 染色体 DNA 和高分子量 RNAC. 钾离子和 SDSD. 蛋白质和细胞膜10. SSCP 电泳方式为： DA. 普通琼脂糖凝胶电泳B. 低熔点琼脂糖凝胶电泳C. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳D. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳11. SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是：BA. EDTAB. 甲酰胺C. 溴酚兰D. Tris-HCl12.SSCP分离单链DNA片段是依据：BA. 单链 DNA 分子量大小B. 单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小C. 单链 DNA 带电量的大小D. 单链 DNA 分子量和带电量的大小三、是非1. 迄今发现的质粒都是环状的。（错）2. 质粒DNA提取时，溶液

8、II需新鲜配置。（对）3. 如果溶菌酶溶液中pH值低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。（对）4. 碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。（错）5. CsCl-EB密度梯度离心法纯化SC DNA原理是根据EB可以较多地插入到 SC DNA中，因而沉降速度较快。（错）6. 酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度 要高。（对）7. 氯霉素扩增DNA时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不 够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。（对）8. 碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。（错）9. 酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度 要高

9、。（对）10. SSCP对长链DNA或RNA的点突变检出率要比短链的高。（错）11. SSCP分析中非变性PAG电泳分离不能反映出分子量的大小。（对）12. SSCP可以检测出所有的单点突变。（错）13. 点突变对SSCP检出率的影响取决于该点在DNA链上的位置，点突 变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来。（错）四、简答1.简述溶液I、II、III所包含成分及生化作用原理溶液I含葡萄糖和EDTA，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机 械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶 对DNA的降解作用（Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基），另外

10、,EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的 环境。溶液II含NaOH和SDS,核酸在pH大于5小于9的溶液中是稳定的， 但当 pH 大于 12 或小于 3 时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液 II中的NaOH浓度为0.2N，加入抽提液液时，该系统的pH就高达12.6，因 而促使染色体DNA与质粒的变性。SDS是离子型表面活性剂，它主要功能 有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中 的核蛋白；SDS能与蛋白质结合成为R1-O-SO3R2+-蛋白质的复合物，使蛋 白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在

11、以后的提 取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 Rnase 去除 RNA 时）受到干扰。溶液III是NaAc-Hac的缓冲液（pH4.8）。用pH4.8的NaAc溶液是为了 把 pH12.6 的抽提液 pH 调回中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定 存在。而高盐的 3MnaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS- 蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而 互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较 小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。2小量制备质粒 DNA 时发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割，分

12、析可能原 因及解决办法。由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去 除干净导致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备 物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化 DNA。3溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应 该如何处理？添加DTT、巯基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。 4从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用两种不同 的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除 去核酸制品中残量酚。（此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全 抑制RNA酶的活性

13、，它还能溶解带有长poly （A）段的RNA分子。使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液可以使这两个问题迎刃而解，） 5在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1-0.25M?在 pH 为 8 左右的 DNA 溶液中， DNA 分子是带负电荷的，加一定浓 度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子 之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的 盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀 的 DNA

14、中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要 进行洗涤或重沉淀。6. LiCl在质粒DNA提取中的作用是什么？ 沉淀大量蛋白质和高分子 RNA。7. 简述 PCR-SSCP 基本过程。1）PCR 扩增靶 DNA；2）将特异的 PCR 扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空 间结构的单链 DNA 分子；3）将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4）最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链 DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发 生改变，进而推断DNA片段中有碱基突变。8. 简述 RNA -SSCP 的基本原理。RNA 有

15、着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变 很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不 易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。9. SSCP 图谱一般是二条单链 DNA 带，有时可能只呈现一条 SSDNA 带或 三条以上的原因是什么？主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的立体构象，有时三条以上 的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。10. 分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状DNA在凝胶中迁移率 大小顺序是什么？超螺旋环状DNA迁移最快，其次为线状DNA，最慢为带切口环状DNA。11. 影响DNA迁移率的因素有哪些？影响DNA迁移率的因素有：DNA分子的大小，琼脂糖浓度，DNA的构象，所加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。