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1、分子生物学试题(质粒提取与纯化;SSCP部分)一、填空I. 质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法,包括:非离子型或离子型去圬 剂,有机溶剂,碱或加热处理。2用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到0.8 X 109细胞/ml时,即可通过 离心收集菌体。收集菌体使用定角转子,离心的速度以8000r/min为宜。3在分离质粒DNA的菌体培养过程中,加入氯霉素有两个好处:可以扩增 质粒DNA;抑制了菌体的数量,有利于裂解。4. 常使用的质粒纯化方法都利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状两 个性质。5. 由于不同构型的DNA插入EB的量不同,它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁 移率也不同,超螺旋的共价闭合环状结构
2、的质粒DNA (SC)的泳动速度 最快,一条链断裂的开环状质粒DNA (OC)泳动速度最慢,二条链断裂 的线性DNA (L)居中,通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的 DNA分别开来。6. 超离心法纯化质粒DNA时,选用CsCl作介质的优点是:CsCl与不同 DNA起反应;CsCl可以自动形成密度梯度,从而使不同分子量的DNA 分子得以分开。7. SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂,它有四个作用:溶解膜蛋 白及脂肪,从而使细胞膜破裂;溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸 释放出来;对RNase、Dnase有一定的抑制作用;SDS能够与蛋白质结 合形成RfO-SO3-R2+-蛋白质复
3、合物,使蛋白质变性沉淀。8碱裂解法所用溶液I、II、III的体积比为:2:4:39. 质粒提取中溶液II的主要成分为SDS和NaOH。10. 溶液III中钾是3mol/L,乙酸根是5mol/LII. LiCl可沉淀大量蛋白质和高分子RNA。12. 1OD260=50gg 质粒 DNA/ml。13. 在碱变形法提取质粒DNA实验中,聚乙二醇用于沉淀质粒DNA。14. 残留在DNA样品中的酚可抑制酶的活性。15. 质粒DNA提取中酚的pH值范围是pH7.8pH8.0o16. 乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有:乙酸铵、氯化钠和乙酸钠。17. SSCP电泳方式为非变性聚丙烯酰胺凝胶电
4、泳。18. SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳 分离的。19. 影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。20. SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是:甲酰胺21. 点突变对 SSCP 检出率的影响不仅仅取决于该点在 DNA 链上的位 置,更取决于该位置对维持立体构象作用的大小。二、选择1 质粒提取中溶液II的主要成分为:BA. SDS 和 EDTAB. SDS 和 NaOHC. EDTA 和 NaOHD. SDS 和冰乙酸2分离质粒DNA时,用蔗糖的目的是:BA. 抑制核酸酶的活性B. 保护DNA,防止断裂C. 加速蛋白质变性D. 有利于细胞破碎3. 关
5、于碱解法分离质粒DNA,下面哪一种说法不正确?: DA. 溶液I的作用是悬浮菌体B. 溶液II的作用是使DNA变性C. 溶液III的作用是使DNA复性D. 质粒DNA分子小,所以没有变性,染色体变性后不能复性4. 质粒DNA提取中酚的pH值范围:DA. pH6.5pH7.0B. pH8.0pH8.5C. pH6.8pH7.0D. Ph7.8pH8.05. CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是:CA. 氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去B. 氯化铯可以较多地插入到 SC DNA 中去C. EB可以较多地插入到线状DNA中去D. EB可以较多地插入到SC DNA中去6同一种质粒DN
6、A,以三种不同的形式存在,电泳时,它们的迁移速率是:BA. OC DNASC DNAL DNAB. SC DNAL DNAOC DNAC. L DNAOC DNA.SC DNAD. SC DNAOC DNAL DNA7. 用碱法分离质粒DNA时,染色体DNA之所以可以被除去,是因为:CA. 染色体 DNA 断成了碎片B. 染色体DNA分子量大,而不能释放C. 染色体变性后来不及复性D. 染色体未同蛋白质分开而沉淀8. 10D26o相当于每毫升质粒DNA: AA. 50gB. 100gC. 50ngD. 100ng9. 加入溶液III后出现的白色絮状沉淀不包括:AA. 质粒DNA和小分子量RNA
7、B. 染色体 DNA 和高分子量 RNAC. 钾离子和 SDSD. 蛋白质和细胞膜10. SSCP 电泳方式为: DA. 普通琼脂糖凝胶电泳B. 低熔点琼脂糖凝胶电泳C. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳D. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳11. SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是:BA. EDTAB. 甲酰胺C. 溴酚兰D. Tris-HCl12.SSCP分离单链DNA片段是依据:BA. 单链 DNA 分子量大小B. 单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小C. 单链 DNA 带电量的大小D. 单链 DNA 分子量和带电量的大小三、是非1. 迄今发现的质粒都是环状的。(错)2. 质粒DNA提取时,溶液
8、II需新鲜配置。(对)3. 如果溶菌酶溶液中pH值低于8.0,溶菌酶就不能有效发挥作用。(对)4. 碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。(错)5. CsCl-EB密度梯度离心法纯化SC DNA原理是根据EB可以较多地插入到 SC DNA中,因而沉降速度较快。(错)6. 酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁,但碱法用的溶菌酶的浓度 要高。(对)7. 氯霉素扩增DNA时,加氯霉素的时间是重要的,因为加得太早,菌数不 够,加入时间过迟,菌龄过老,容易自溶。(对)8. 碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。(错)9. 酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁,但碱法用的溶菌酶的浓度 要高
9、。(对)10. SSCP对长链DNA或RNA的点突变检出率要比短链的高。(错)11. SSCP分析中非变性PAG电泳分离不能反映出分子量的大小。(对)12. SSCP可以检测出所有的单点突变。(错)13. 点突变对SSCP检出率的影响取决于该点在DNA链上的位置,点突 变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来。(错)四、简答1.简述溶液I、II、III所包含成分及生化作用原理溶液I含葡萄糖和EDTA,葡萄糖能增加溶液的黏度,防止DNA受机 械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶 对DNA的降解作用(Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基),另外
10、,EDTA 的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的 环境。溶液II含NaOH和SDS,核酸在pH大于5小于9的溶液中是稳定的, 但当 pH 大于 12 或小于 3 时,就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液 II中的NaOH浓度为0.2N,加入抽提液液时,该系统的pH就高达12.6,因 而促使染色体DNA与质粒的变性。SDS是离子型表面活性剂,它主要功能 有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜;解聚细胞中 的核蛋白;SDS能与蛋白质结合成为R1-O-SO3R2+-蛋白质的复合物,使蛋 白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在
11、以后的提 取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用 Rnase 去除 RNA 时)受到干扰。溶液III是NaAc-Hac的缓冲液(pH4.8)。用pH4.8的NaAc溶液是为了 把 pH12.6 的抽提液 pH 调回中性,使变性的质粒 DNA 能够复性,并能稳定 存在。而高盐的 3MnaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS- 蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而 互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后,能形成溶解度较 小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。2小量制备质粒 DNA 时发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割,分
12、析可能原 因及解决办法。由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够,没有去 除干净导致。大多数情况下,用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备 物中的杂质,如果总是依然存在,可用离心柱纯化 DNA。3溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感,应 该如何处理?添加DTT、巯基乙醇,或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。 4从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。方法是先用酚:氯仿抽提,然后再用氯仿抽提。原理:使用两种不同 的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除 去核酸制品中残量酚。(此外,酚虽能有效地使蛋白质变性,却不能完全 抑制RNA酶的活性
13、,它还能溶解带有长poly (A)段的RNA分子。使用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液可以使这两个问题迎刃而解,) 5在用乙醇沉淀 DNA 时,为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1-0.25M?在 pH 为 8 左右的 DNA 溶液中, DNA 分子是带负电荷的,加一定浓 度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子 之间的同性电荷排斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的 盐溶液浓度太低时,只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合,这样就造成 DNA 沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好,在沉淀 的 DNA
14、中,由于过多的盐杂质存在,影响 DNA 的酶切等反应,必须要 进行洗涤或重沉淀。6. LiCl在质粒DNA提取中的作用是什么? 沉淀大量蛋白质和高分子 RNA。7. 简述 PCR-SSCP 基本过程。1)PCR 扩增靶 DNA;2)将特异的 PCR 扩增产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空 间结构的单链 DNA 分子;3)将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;4)最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果,若发现单链 DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构象发 生改变,进而推断DNA片段中有碱基突变。8. 简述 RNA -SSCP 的基本原理。RNA 有
15、着更多精细的二级和三级构象,这些构象对单个碱基的突变 很敏感,从而提高了检出率,其突变检出率可达90%以上。另外,RNA不 易结合成双链,因此可以较大量的进行电泳,有利于用溴化乙锭染色。9. SSCP 图谱一般是二条单链 DNA 带,有时可能只呈现一条 SSDNA 带或 三条以上的原因是什么?主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的立体构象,有时三条以上 的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。10. 分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状DNA在凝胶中迁移率 大小顺序是什么?超螺旋环状DNA迁移最快,其次为线状DNA,最慢为带切口环状DNA。11. 影响DNA迁移率的因素有哪些?影响DNA迁移率的因素有:DNA分子的大小,琼脂糖浓度,DNA的构象,所加电压,温度,嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。