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1、碱处理对大米蛋白分子间作用力的影响责任编辑：admin发布时间：2007-12-14易翠平1姚惠源2谢定1(长沙理工大学生物与食品工程学院1 ,长沙410076)(江南大学食品学院2 ,无锡214036)摘要：通过研究碱处理对大米谷蛋白分子间作用力的影响，表明蛋白浓度9% (w/v)时，蛋白 的黏度和表面疏水性大幅上升9%(w/v)的谷蛋白含量条件下,pH11.5,大米谷蛋 白分子间作用力不发生变化；pH11.512.5,谷蛋白分子内与分子间的二硫键与 巯基发生交换反应，产生聚集同时疏水基团暴露；pH13.0,部分谷蛋白分子的二 硫键与巯基被破坏；pH13.5,谷蛋白分子的二硫键含量显著降低。
2、关键词：碱处理；大米蛋白；黏度；表面疏水性；巯基与二硫；键热特性在蛋白质的提取和加工过程中常常无可避免的用碱处理，强碱处理高浓度的 蛋白时，蛋白质的理化特性会发生较大的变化，巯基与二硫键之间发生交换反应 1或者B-消除反应等2-3。碱处理对蛋白质分子结构的影响，Ishino等报道 了碱变性大豆蛋白的分子间相互作用1; Gaucher-Choquette等报道了碱处理 对牛血清蛋白、免疫球蛋白、12S油菜籽蛋白等五种蛋白质的黏度和巯基及二硫 键的影响4, Ch2ing-YungMa等报道了碱处理对燕麦球蛋白理化特性的影响5, 关于碱处理对大米蛋白的分子结构的影响，国内外尚未见报道。1材料与方法1
3、. 1材料与设备大米谷蛋白，根据参考文献6制备。提取出来的蛋白用凯氏定氮法检测蛋白质 含量为99.8%,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验谷蛋白纯度为91.5%。主要设备有NDJ-79型旋转式黏度计,UV-1100型紫外可见分光光度 计,HITACHI650-60荧光分光光度计，差示扫描量热仪(Pyris)。1. 2试验方法1. 2. 1碱处理大米谷蛋白的制备将不同浓度的大米谷蛋白用不同pH值的氢氧化钠室温(25C)搅拌1h，用 1mol/L的盐酸调中性，透析，冷冻干燥后低温保存。1. 2. 2黏度测定将不同pH值处理1h的大米谷蛋白样品倒入样品槽，搅匀，开机使转子在蛋白 液中转动，到指针
4、恒定时记下读数。1. 2. 3差示扫描量热分析(DSC)样品用0.04mol/L NaOH溶液配成8%的蛋白溶液，平衡过夜,取湿基510mg, 用液体坩埚密封后放入DSC测定蛋白热特性曲线;其中温度扫描范围30120C, 扫描速率20C/min，参比:三氧化二铝石英管。1. 2. 4表面疏水性测定将样品用0. 01mol/L、pH11.5Na2 HP04-Na0H 缓冲液稀释至0.002%、0.004%、 0.008%、0.016%,取20uL 的 1-苯胺基-8-萘磺酸(1 - anilino - 8 -naphthalene sulfonic acid,ANS)溶液(8mmol/LANS溶
5、液溶于0. 01mol/L磷酸盐缓冲液)加入 4mL上述配置的蛋白溶液，立即摇匀，在荧光分光光度计中于390nm激发470nm检 测发射荧光强度,用荧光强度对蛋白溶液浓度作图并进行线性回归，以线性回归 斜率作为表面疏水性的指标。1. 2. 5巯基与二硫键分析15mg样品用ImLTris -甘氨酸缓冲液混匀后加4. 7g盐酸胍，用缓冲液定溶至 10mL。测定巯基时，取ImL该液加4mL脲-盐酸胍溶液和0. 05mL 5, 5-二硫代-2 -硝基苯甲酸，于412nm处测取光吸收值。测定二硫键时，取ImL溶液，加0. 05mL 巯基乙醇和4mL脲-盐酸胍溶液，于25C保温lh,然后加入10mL12%
6、的三氯乙酸，继 续于25C保温lh, 3 000r /min离心10min,用5mL12%的三氯乙酸清洗沉淀物2次， 将沉淀物溶于10mL8mol/L脲中，加0. 04mL5, 5-二硫代-2 -硝基苯甲酸，于 412nm处测取光吸收值。计算公式为： uMS m /g = 73. 53A412XD /C 其中：A412412nm吸光值；C样品浓度(mg/mL);D稀释因子,巯基取5. 02,总巯基(巯基+还原二硫键)取10。2结果与讨论2. 1碱处理对大米谷蛋白黏度变化的影响图2不同pH溶液中大米谷蛋白的黏度变化(9%的蛋白浓度)图1表明在pH12. 5的碱液浓度下，在1%7%的浓度范围内，大
7、米谷蛋白的黏度随 蛋白含量的增加略有增加，至9%时大米谷蛋白的黏度迅速增加到1 400mPaS,形 成凝胶。表明在pH12. 5的碱液浓度下，从9%的蛋白浓度开始大米谷蛋白分子间 发生相互作用。图2表明9%的蛋白浓度下，pH值小于11时,碱液中大米谷蛋白的 黏度变化不大，pH值超过11,黏度迅速增大，pH值至12,黏度达到最大，开始呈下 降趋势，pH值超过13,黏度减小到初始值。2. 2碱处理对大米谷蛋白表面疏水性的影响大米谷蛋白的碱变性与其浓度有关，当谷蛋白的浓度小于7%时，蛋白的表面 疏水性基本维持不变，当谷蛋白浓度达到9% ,其表面疏水性大幅上升，说明此时 蛋白的分子构象开始变化，疏水小
8、区暴露。当pH值小于11. 5时，蛋白的表面疏水 性基本维持不变，当pH值在12. 012. 5之间时蛋白的表面疏水性增大,说明此 时蛋白的分子构象开始变化，疏水小区开始暴露;当pH值大于13. 0时，蛋白的表 面疏水性减小，pH值至13. 5,蛋白的表面疏水性降至4 313，说明pH值大于13. 0, 大米谷蛋白的肽链降解，降解增加的亲水基团羧基端和氨基端增加蛋白的亲水性, 疏水性降低。2. 3碱处理对大米谷蛋白巯基与二硫键的影响pH12.5的碱处理对不同浓度大米谷蛋白巯基与二硫键的变化没有显著影响， 但均比谷蛋白的巯基与二硫键含量有所降低。由表2可见,9% ATRP在pH 12. 5开始，
9、巯基与二硫键含量开始降低； pH在13. 5时,二硫键含量已经显著降低。2. 4碱处理对大米谷蛋白热特性的影响蛋白质从天然态到变性态的转变是一个热的综 合效应，包括氢键断裂的吸热反应和疏水键断裂的放热反应7,二者导致的焓 变用差示扫描量热仪(DSC)测定后用于研究多种食品蛋白的变性8 ,比如大豆 蛋白的热变性9 , pH、盐及表面活性剂对燕麦蛋白10 的热特性影响等。 表3结果表明pH12. 5时,大米谷蛋白的变性峰值温度及热焓随着蛋白浓度增加而 增加，在蛋白浓度低于7%时,增加不明显;当蛋白浓度达到9%时，蛋白的变性峰值 温度由8586C迅速增加到92. 119C，热焓也上升到80. 944
10、J/g9%ATRP在pH10. 512. 5范围内，大米谷蛋白的变性峰值温度及热焓随着pH值的增加而增加;超 过12. 5,变性峰值温度及热焓下降。ZhiYong Ju研究认为DSC峰值温度及热焓 随着蛋白颗粒的增大而升高、水解度的增加而降低7 ，从本实验结果看来， pH13. 013. 5变性峰值温度及热焓下降应该是由于谷蛋白在碱液中水解引起的, 变性峰值温度及热焓随着pH值的增加在10. 512. 5范围内增加可能是由蛋白 聚集引起的。3小结pH12. 5的碱液浓度处理蛋白浓度为1%7%(w /v)的大米谷蛋白，黏度变化不 明显;蛋白浓度至9% (w /v)时,黏度迅速增加，形成凝胶。9%
11、 (w /v)的蛋白浓度 下，pH 11,黏度迅速增大，pH12 时,黏度最大，开始呈下降趋势，pH 13,黏度减小到初始值。pH12. 5时,碱处理 大米谷蛋白的表面疏水性变化与蛋白浓度有关，谷蛋白浓度 7% (w /v)时，蛋白 的表面疏水性基本维持不变，谷蛋白浓度达到9% (w /v)，表面疏水性大幅上升。 当谷蛋白浓度9% (w /v) , pH 13.(时，蛋白的表面疏水性 减小，pH13. 5,蛋白的表面疏水性降至很低。pH12. 5的碱处理对不同浓度大米 谷蛋白巯基与二硫键的变化没有显著影响，但均比谷蛋白的巯基与二硫键含量有 所降低。9% (w /v)的谷蛋白含量条件下，pH 1
12、2. 5,巯基与二硫键含量开始降低；pH13. 5时，二硫键含量显著降 低。碱处理大米谷蛋白的热特性表明，pH12. 5时，大米谷蛋白的变性峰值温度及 热焓随着蛋白浓度增加而增加，在蛋白浓度低于7% (w /v)时,增加不明显；当蛋白 浓度达到9% (w /v)时，蛋白的变性峰值温度由8586C迅速增加到92. 119C, 热焓也上升到80. 944J /go 9%ATRP (w /v)、pH10. 512. 5时,大米谷蛋白的 变性峰值温度及热焓随着pH的增加而增加，超过12. 5,变性峰值温度及热焓下 降。参考文献1 K. Ishino , S. Okamoto. Molecular in
13、teraction in alkali de2natured soybean p roteins. Cereal Chem. 1975, 52: 9 - 212 张英君，陈有亮,董雅芳1碱处理引起蛋白质的变旋和赖丙复合物的生 成1肉类工业，2001 (2) : 31 - 363 Hung - Min Chang, Cheng - Fang Tsai , Chin - FungL i. Changes of amino acid composition and lysinoalanine for2 mation in alkali p ickled duck eggs. J. Agric. Food Chem. 1999, 47: 1495 1500摘自：中国粮油学报2007年 第4期
