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1、人T细胞分离与体外培养实验方案一.实验目的从人外周血中分离PBMCs,利用CD3和CD3/CD28免疫磁珠分离并扩增T细胞, 用于慢病毒载体的感染。二.实验过程1. 人外周血单个核细胞的分离(每mL外周血大约可获得1X106个单个核细胞) 采血，稀释(外周血：稀释液=1： 1);在离心管中加入人淋巴细胞分离液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周 血(Ficoll：稀释血=1 : 2)；(3) 20C, 440g,离心 20-30min；离心后轻轻吸取中间白膜层，移入另一试管中；加入足量的稀释液充分洗涤，400g,离心5min，弃上清； 细胞沉淀加1640培养液重悬，即可用于T细胞的磁珠分选。2.
2、CD3+T细胞分选 适量的MACS缓冲液洗涤PBMCs (107/mL), 300g，离心10min,去上清；MACS缓冲液重悬PBMCs (80|iL/107PBMCs),加入CD3免疫磁珠 (20|iL/107PBMCs),混匀，4C孵育 15min；(3) MACS 缓冲液(1-2mL/107cells)洗涤细胞 1 次，300g,离心 10min,弃 去上清；500 L MACS缓冲液重悬细胞； 将MS分离柱放置于磁力架上，加入500 L MACS buffer预清洗分离柱;将步得到的细胞悬液加入预先洗涤过的MS分离柱，先流出的细胞为未 标记的CD3-T细胞。MACS缓冲液洗涤分离柱3
3、次； 将分离柱从磁力架上取下，放入合适的管子内，加入1mLMACS缓冲液至 分离柱内，洗脱液即为CD3+T细胞，细胞计数后，用含10%胎牛血清的 RPMI1640培养基重悬。3. CD3+T细胞的激活和扩增CD3/CD28免疫磁珠预先洗涤 涡旋30s以上重悬CD3/CD28免疫磁珠； 取需要量的CD3/CD28免疫磁珠加至一个新的管中； 加入与磁珠体积相等的缓冲液（至少1mL），混匀（涡旋5min或者颠 倒混匀5min）； 将管子置于磁力架上1min，弃去上清液； 将管子从磁力架上取下，加入与第步取出的磁珠体积相等的培养液 重悬CD3/CD28免疫磁珠。CD3+T细胞激活和扩大培养 将CD3+
4、T细胞调整密度至1 X 106/mL于24孔细胞培养板中培养； 加入25L预先洗涤并用培养液重悬的CD3/CD28免疫磁珠，使得磁 珠和细胞的比例为1： 1； 37C, 5%CO2培养箱中培养3天。 继续培养7-10天，培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640,内加rIL-2（工作浓度30IU/mL），每2-3天更换1次培养液，细胞数达到（）X106/mL或者培养液发黄时进行传代，细胞密度控制为（）X106/mL。 如果用于流式分析，在染色前需将磁珠去除，将管子置于磁力架上 1-2min,将含有细胞的上层液体转移至新的管子以分离磁珠。4. CD 3+T细胞的鉴定细胞活性鉴定：4g/L台盼蓝与细胞悬液（1： 9）染色3min后，置于显微 镜下观察细胞存活率。细胞存活率二染色阴性细胞数/细胞总数X100%。计算200个细胞中活细胞的百分比， 流式细胞术检测：FITC标记的抗人CD3抗体和PE标记的抗人CD8抗体， 按1： 1抗体/105细胞的比例，4C避光孵育染色30min，预冷的PBS洗涤 后，重悬细胞待流式细胞术检测。同型对照抗体为小鼠IgG-FITC，小鼠IgG-PE。
