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1、RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7保存方法：避免反复冻融或者经常变换温度，以防影响产品稳定性。保存温度：-20C 试剂组成：ATP 100灿CTP 100卩1GTP 100卩1UTP 100卩1RQ1 RNase-Free DNase 110U 醋酸钠 3.0M(pH 5.2) 1m1 T7线性化对照DNA 10卩1 酶混合物，T7 RNA聚合酶120卩1 T7 5 X转录缓冲液240卩1 无核酸酶水 1.25m1质量控制：32P标记RNA除另外加入5卩Ci a -32P CTP 400Ci/mmo1之外，其它参照TB166所述方案进
2、行。在 这些条件下，经TCA沉淀计算，会有40卩g的RNA合成。RNA 完整性：上述转录反应产物经凝胶电泳分析和放射自显影分析，最低标准应当有90%的RNA按预期大小迁 移成一条单一的带。I. 概述体外转录反应广泛用于从重组DNA模板合成微克量的RNA探针。大多数用于生产RNA探针的转 录反应多用于放射标记核糖核酸的合成，而不是合成大量的RNA。但体外转录也用于需要大量具生物 活性RNA的时候。大量的RNA产物可用于体外翻译、合成tRNA、rRNA或其它小的功能性RNA、 RNA病毒基因组和核酶，亦用于RNA拼接的底物、RNA的二级结构、反义RNA以及RNA-蛋白相 互作用的研究。RiboMA
3、XTM Large Scale RNA Production Systems可产生微克量的 RNA，转录产物可达 14kb；但是， 通常用于生产56kb的转录产物。RiboMAXTM Systems在1ml反应体系中可稳定地合成25mg RNA， 大约比标准 Riboprobe System 转录反应多 1020 倍。RiboMAXTM Systems 不同于 Riboprobe System 之 处主要有三个基本方面：(1)使用HEPES(pH 7.5)缓冲液而不是Tris-HC1(pH 7.9)缓冲液，rNTP和镁浓 度调整到接近T7 RNA聚合酶活性浓度。 反应中添加了酵母无机焦磷酸酶(
4、pyrophosphatese)。 体 系中含有rRNasein RNA酶抑制剂。RiboMAXTM Systems另外的优点是，合成高质量的RNA可用于兔 网状细胞翻译系统的体外翻译。增强的翻译能力尤其体现在高RNA浓度通常抑制体外翻译的时候。尽 管影响RNA产物的改良和翻译效率的原因还不太清楚，RiboMAXTM Systems对希望合成大量用于体外 翻译RNA的研究工作者来说是有用的。成分中对翻译抑制作用的减少，可能对其它需要应用生物活性 RNA 的工作来说，亦是极为有利的。因为RiboMAXTM Systems产生大量的RNA,这些系统不推荐用于生产高特异活性的RNA探针。 产生此种探
5、针的放射标记核苷酸的量将会极为昂贵。II. 定货信息RiboMAXTM Large Sca1e RNA Production Systems-T7 P1300每个系统中含足够的试剂用于1m1反应或50个标准的20卩1反应体系。包括： 酶混合物(RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、酵母无机焦磷酸酶)120卩1 5 X转录缓冲液 240卩1 各种 rNTP, 100mM 100卩1 线性对照DNA, 1mg/m1 10卩1 3M 醋酸钠, pH 5.2 1m1 无核酸酶水 1.25m1 技术材料 1 份保存：所有试剂存放于-20C。长期使用或使用不频繁时，可存放在70C。RiboMAXTM System
6、s存 放和使用合适时,至少可保持6 个月稳定。注意避免多次冻融。IIIDNA 模板的准备用户自备的试剂：(溶液组成见 VI 部分) 氯仿:异戊醇(24:1) TE饱和酚(pH 8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1) 乙醇(70%和 95%)A. 模板线性化理想 RNA 合成依赖于使用高质量的 DNA 模板，氯化铯纯化和 Wizard P1us Minipreps DNA Purification System(A7100)方法获得的DNA均适用于转录反应。在DNA中不含RNA酶至关重要。如 果可疑含有 RNA 酶，用蛋白激酶 K(100卩g/m 1)和 SDS(0.5%)在 50mM Tri
7、s-HC1(pH 7.5)和 5mM CaC12 中， 37C处理30min(6)，再用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，再用乙醇沉淀(见IV. B第36步)。DNA模板通常在体外转录合成特定长度RNA之前先线性化，用合适的限制性内切酶线性化DNA， 再进行纯化，例如酚抽提后，乙醇沉淀或者用Wizard DNA C1ean-Up System(A7280纯化。最好比转录 反应量DNA多30%用于补偿DNA纯化或凝胶电泳观察时的损失。严格避免使用产生3游离端的限制性内切酶(见表1)，使用这样的模板在转录时，除预期转录产物 之外，还会有额外的转录产物(7)，额外的转录产物会包含与预期转录产物
8、互补的序列，也会产生和载 体DNA相应的序列。如果必须使用这些酶，可以用DNA聚合酶I大K1enow片段(M2201)在转录前钝 化线性模板。Tab1e 1通常产生 3游离端的限制酶略PCR合成的含合适噬菌体转录启动子的DNA可用于转录反应。噬菌体启动子序列可以用带有噬菌 体启动子序列的载体或5端带有启动子寡核苷酸在PCR反应时与DNA连接oPCR合成的DNA可以用 Wizard PCR Preps DNA Purification System(A7170进行纯化。纯化的线性DNA在转录前应当用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，核实完全线性化且保证 出现一个干净(未降解的)与预期大小相附的
9、DNA片段。B. 3游离端的钝化。略IV 转录方案本方案依据2个发表的用HEPES缓冲液(1)和酵母无机焦磷酸酶方案修改而成。与标准转录方案(8) 相比，本系统进行了改进，文献3资料表明，本系统合成的RNA翻译能力有所增强。提供的线性化对照DNA，含有一个荧光素酶基因在T7启动子控制之下，这个DNA可产生一个 1800bp含有po1y(A)尾巴的转录产物，因为荧光素酶必须全长才能表现活性，对照DNA的转录和翻译 用荧光素酶分析是一个极为方便的方法以核实是否为全长转录。A.微克量RNA的合成1. 室温配制合适的T7 RNA聚合酶反应体系。注意：DNA可在低温下于亚精胺中沉淀。按所示顺 序加入反应
10、成分，在加入反应体系之前，在水中小心溶解DNA模板。这些反应体系可按比例减少至所需要的模板量。1个1ml反应体系通常在24h内产生25mg的RNA。方便起见，等体积混合4种100mM的rNTPs至100mM溶解，即每种rNTP 25mM。T7反应体系组成样品反应体系对照反应体系T7 转录 5 X buffer200卩l4.0卩lrNTPs(25mM ATP,CTP,GTP,UTP)300卩l6.0卩l线性DNA模板(共50100卩g)于无核酸酶水中400卩lControl DNA 1.0卩l无核酸酶水-7.0卩lT7 RNA聚合酶混合物100卩l2.0卩l总体积：1,000卩l20.0卩l2.
11、 小心轻吹打混匀混合物，于37C孵育24h。B 转录后除去DNA模板DNA模板可以在转录反应之后用DNA酶消化除去,Promega的RQ1无RNA酶的DNA酶(M6101) 经测试可以降解DNA且保持RNA的完整。在某些方面，可不必除去DNA模板,例如，110卩l的1:1050 转录产物的稀释液可以直接加入兔网状细胞翻译系统进行体外翻译反应。如果需要测定精确的RNA浓 度，应当用DNA酶进行处理，除去潜在的抑制或干扰成分。注意：如果未进行 DNA 酶处理，进行下面第 3 步。用户自备的试剂：(溶液组成见第VI部分) TE-饱和酚(pH 4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1) 氯仿:异戊醇(2
12、4:1) 异丙醇 乙醇(70%和 95%)体外转录反应操作之后：1 以模板DNA 1U/yg的量，加RQ1无RNA酶的DNA酶。2. 37C，孵育 15min。3. 用1体积的TE-饱和酚(pH 4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，涡悬1min,于离心管中以最大速度 离心 2min。4将上层水相转移到1个新的管子中，加1体积的氯仿:异戊醇(24:1)。涡悬1min,按第3步方法 离心。此时非目的核酸可以被除去(第IV部分C)或者RNA可能直接沉淀(下面第5步)。5. 将上层水相转移到1个新的管子中，在微离心管中快速离心10s，用枪头吸去底层液相，可除 去所有转移过来的氯仿。加0.1倍
13、体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和1倍体积的异丙醇或2.5倍体积的95% 乙醇，混匀，冰浴25min,最大速度离心10min。注意：异丙醇比乙醇沉淀的非目的核苷酸少。6. 小心倒掉或吸弃上清，用1ml 70%乙醇清洗沉淀。真空干燥后，重新溶解RNA样品于TE buffer 或无核酸酶水，至转染反应时所需体积。-70C保存。C. 用色谱法除去外源核苷酸。可用数次异丙醇沉淀或乙醇沉淀除去非目的核苷酸，最好的方法是，于10mM Tris-HCl(pH 7.5)和 0.1% SDS 中通过小的 Sephadex G50 或 G100 柱子，用 Size exclusion chromatography
14、 法除去非目的核 苷酸。RNA和外源核苷酸分离之后，RNA样品应当立即乙醇沉淀(按IV部分B第5,6步)，-70C保存。D. 测定RNA浓度并电泳观察用户自备的试剂：(溶液成分参见 VI 部分) RNA 上样 buffer RNA 样品 buffer除去DNA模板和非目的核苷酸后，RNA的浓度可以很容易用紫外分光光度计定量测定。用260nm 和280nm波长光测定1:1001:300 RNA稀释液的吸收值。1个A260单位大约等于40卩g/ml RNA。如果 RNA 中不含污染蛋白或酚， 260 和 280 的吸光度比值应等于 2.0。相应地，痕量的放射标记的核苷酸可 以加入反应(如32P U
15、TP),目的成分的百分含量可以用TCA沉淀法测定。但是，除合成探针以外，许多 应用都不需要此步操作。DNA 酶处理的体外转录产物可以用变性凝胶电泳验证 A260 定量的精确性和全长转录产物的完整 性。RNA Marker(G3191)可用于测定RNA样品的大小和浓度。线性对照DNA产生一个大约1800b的转 录产物。此 RNA 可以加入翻译抽取物中(兔网状细胞或小麦病原)，功能荧光素的表达可以用 1 个非放 射分析方法(Promegas Luciferase Assay System+ E1500)进行测试。依据转录产物的长度 (0.7%2.0%琼脂糖对介于 200 至数千核苷酸的转录产物； 5%丙烯酰胺从 501000核苷酸)，准备1个1 XTAE(含0.5卩g/ml溴化乙锭)凝胶或1个丙烯酰胺mini胶。尽管变性胶(含 甲醛、乙二醛和 8M 尿素)保证了 RNA 的最大变性，但我们发现，可通过上样甲醛/甲酰胺变性的 RNA 样品于非变性胶上,可以最好且容易地获得结果。加12卩1 RNA于1820卩l RNA样品buffer中，加25卩1 RNA上样buffer，6570C加热510min,点样。按DNA样品分析的标准条件跑胶。E戴帽RNA转录产物的分析多
