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1、西藏自治区林芝地区波密县羊肚菌中蛋白质干重含量的测定具体实验方案蛋白质测定方法方法灵敏度特点紫外吸收法较为灵敏用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正凯氏定氮法低（0.2-1.0mg）干扰少，费时太长，用于标准蛋白的测定测定方法实验方案（1）紫外吸收法1.实验原理a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯比耳定律：A=bc，当入射光波长及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。 定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得
2、对应的浓度值，即未知样的含量。 2.仪器与试剂仪器：紫外-可见分光光度仪，比色管（10ml的5个），吸量管。试剂：标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液（羊肚菌溶解液）。3.实验步骤A.基本操作启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比（参比溶液不可取出）.在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：400
3、nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描）将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。B.吸收曲线的制作:（找出最大吸收波长）将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为0.1984。 C.标准曲线的制作：在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件（测量波长：278.00 nm）。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定以上所配
4、标准溶液的吸光度A278，并以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：D.样品测定：配制三份待测蛋白质溶液，（取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度）按上述方法测定278 nm处的吸光度。得吸光度依次为0.3906，0.3765，0.3848。平均值为A278=0.3840,根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待 测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。转换后待测蛋白质溶液的浓度为C= 0.6101mg/mL 10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。4.注意事项A.准备工作：在测量前应把机器预热半小时。溶液一定要配制准确,
5、以防影响实验效果,保证点在一条直线上。由于蛋白质的紫外吸收峰常因PH值的改变而改变，故进行样品测定时的PH最好与标准曲线制作时的PH值一致。B.测量工作：吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。（2） 凯氏定氮法1.实验原理蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中
6、除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。2.仪器与试剂硫酸铜（CuSO45H20）硫酸钾硫酸（密度为1.8419g/L）硼酸溶液（20g/L）氢氧化钠溶液（400g/L）0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。微量定氮蒸馏装置。3.实验步骤样品消化称取样品约2.00g（0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡
7、沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。定氮装置的检查与洗涤检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子
8、a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。3、碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂23滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。样品滴定以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。数据分析利用数据分析软件sass对两种方法测定的数据进行对比分析，确定最终结果
