《3-羟基丙酸合成过程中关键途径的构建及优化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《3-羟基丙酸合成过程中关键途径的构建及优化（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、3-羟基丙酸合成过程中关键途径的构建及优化3-羟基丙酸(3-hydroxypropionicacid,3-HP)是乳酸的羟基异构体,是合成很多医药化工中间体的重要前体物质,具有广泛的应用前景。但目前生物法利用甘油合成3-HP最主要的问题是其产量还未达到工业化水平,因此构建性能优良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大肠杆菌EscherichiaColiBL21(DE3)为出发菌株,构建了合成3-HP的代谢路径,引入了甘油脱水酶再激活因子GDFW辅酶NAD再生途径,并在基因组上为合成乙酰CoA的基因acs更换了trc强启动子,最后对构建的基因工程菌发酵生产3-HP能力进行了考察，具体研究
2、内容如下:1.克隆来源于KlebsiellapneumoniaeDSM2026甘油脱水酶基因dhaB及再激活因子基因gdrA,采用不同的表达载体构建了重组质粒pETDuet-dhaB1-4、pET28a-dhaB1-4和pCDFDuet-dhaB1-4;E.coliBL21(DE3)(pET-28a-dhaB1-4/pETDuet-dhaB1-4/pCDFDuet-dhaB1-4)甘油脱水酶酶活依次为11.56U/mg、7.94U/mg和6.94U/mg。同时克隆表达来自Cupriavidusnecator的醛脱氢酶基因GabD4,得到重组质粒pCDFDuet-tac-GABabD4。与实验室
3、前期构建的含有Azospir川umbrasilense的内源性基因a-酮戊二酸半醛脱氢酶的重组质粒pCDFDuettac-Tukgsadh比较,酶活分别为E.coliBL21(DE3)pCDFDuet-tacTUkgsadh:3.11U/mg,E.coliBL21(DE3)pCDFDue-tac-GabD4:1.71U/mg。共表达得到工程菌株E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tacTUkgsadh/pET-28a-dhaB1-4)、E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tacTUkgsadh/pETDuet-dhaB1-4)、E.coliBL21(DE3)(pCD
4、FDue-tacGabD4/pET28a-dhaB1-4)和E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tacGabD4/pETDuet-dhaB1-4)在摇瓶发酵培养基中培养38h,3-HP的最高产量分别为0.37g/L、1.14g/L、0.31g/L和0.86g/L。说明使甘油脱水酶和醛脱氢酶分别在不同拷贝数的质粒上表达来平衡二者的酶活,更适合3-HP的合成。2. 为提高3-HP的产量,进一步优化了其合成途径,包括甘油脱水酶再激活因子和辅酶NAD再生途径的引入以及乙酰CoA启动子的更换。克隆来源于K.pneumoniaeDSM2026中的甘油脱水酶再激活因子基因gdrB,构建了E.c
5、oliBL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tacdhaB-gdrAB),在摇瓶发酵培养基中培养38h后3-HP产量提高到5.12g/L,相较之前提高了4.5倍。与前期构建的辅酶再生的串联重组质粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和pCDFDuet-tac-sthA-TUkgsadh共表达后,摇瓶发酵38h后,结果显示添加了辅酶再生基因后的工程菌，3-HP的产量反而降低，通过分析发现3-HP产量降低的主要原因是表达sthA和gpd1两个基因后,由于代谢途径中氧化还原力的不平衡导致途径中缺乏NAD+从而降低了醛脱氢酶的活性。除此之外，乙
6、酰CoA合成过程中可以通过三竣酸循环经氧化磷酸化释放出大量的ATP供细胞生长和物质合成，因此本实验采用CRISPR-Cas9因编辑系统将合成乙酰CoA基因acs的启动子替换为trc强启动子,构建了E.coliBL21(DE3)T(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB),该工程菌株发酵培养38h后,3-HP产量达到5.5g/L,菌株生长状况良好,提前达到了稳定期。3. 以工程菌E.coliBL21(DE3)T(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuettac-dhaB-gdrAB)为出发菌株，优化了5L发酵罐中3-HP的发酵工艺，发酵过程中控制pH稳定在7.0,3-HP产量为8.79g/L,比pH不控制的情况提高了68%在pH恒定为7.0的基础上,在甘油浓度下降至15g/L时开始添加,并维持甘油浓度在15-20g/L之间，发酵结束后3-HP产量达到12.11g/L。相比未补加甘油提升了38%。在此基础上每隔12小时补加一次0.02g/L的辅酶VB12,3-HP产量提高至14.10g/L,提高了16.43%。
