《绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达（22页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、绿色荧光蛋白(FP)基因的克隆和体现背景知识绿色荧光蛋白(reen fluorscen prti,GF）是一类存在于涉及水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,FP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3个外显子构成,长2.6kb;GFP 是由23 个氨基酸所构成的单体蛋白,相对分子质量为7.0kMr,其蛋白性质十分稳定，能耐受0解决。996年的晶体构造被解出，蛋白质中央是一种圆柱形水桶样构造，长40 ，宽240 n,由11 个环绕中心螺旋的反平行折叠构成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段
2、覆盖,底部由一种短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的SrT-Gly自身环化和氧化形成.996年GFP 的晶体构造被解出，蛋白质中央是一种圆柱形水桶样构造，长0 nm，宽24 nm,由11 个环绕中心螺旋的反平行折叠构成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一种短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。实验一 质粒D的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒NA提取措施：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒NA,比较以便、省时，提取的质粒DNA质量较高,可用于NA的酶切、PCR
3、甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外,可以自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DA分子，分子量范畴从1k到20b。质粒A可持续稳定地处在染色体外的游离状态,但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后裔。在大多数状况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相似的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一种或几种拷贝,称为严谨型质粒,有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严,称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达1-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到
4、克制时(例如经氯霉素解决）,细菌染色体虽不再增长,但松弛型质粒NA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有某些抗药标记，当质粒DA用人为的措施转化进细菌时，转化后的细菌会体现出质粒基因所具有的新的生物体现型,例如,把一种具有抗药基因的质粒转入细菌后,本来无抗药性的细菌则体现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特性，可证明质粒已转入宿主细菌中,这样就可以作为转化菌的选择性标记。质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DN分子。目前已有许多措施可用于质粒D的提取,它们都涉及三个基本的环节：细菌的生长和质粒的扩增;菌体的收集裂解
5、,质粒DNA的分离;质粒D的纯化。1、 细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一种单菌落，接种到含合适抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如pUC系列)来说，只要将培养物放到原则的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒NA。但对于严谨型质粒（如R32)来说,则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行选择性扩增。2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离质粒分离的基本原理是运用宿主菌(一般是大肠杆菌菌株)DNA与质粒DN之间的两种重要性质差别:（1)大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DA大得多。（2）从细胞中提获得到的
6、大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DA是共价闭合的环状分子。这里重要简介碱裂解法的基本原理:在细菌悬浮液中加入SS（十二烷基硫酸钠）和NOH使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此解决可破坏碱基配对,故可使细菌的线状染色体N变性，但闭环质粒DNA链由于处在拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时(如加入酸性的a或Ka中和碱性NOH),质粒DA链迅速得到精确配对,重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体DN与变性蛋白质、RN分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。3、质粒DN的提纯对于小量制备的质粒DNA,通过苯酚抽提、RA酶消化和酒精沉淀等简朴环节
7、除去残存蛋白质及RA,达到纯化的目的。质粒DA分子具有三种构型：共价闭合环形A(cccDNA,C构型）、开环DNA(O构型）和线性分子（构型）。在细菌体内，质粒DN是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相似,但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是S DA,其后依次是 NA和OC DN。三、实验材料、仪器及试剂1.在具有pGP-N3质粒的H5平板上菌落上挑取菌种,置于具有5L LB培养基的试管中。摇晃过夜。 在具有pET-2a质粒的平板上挑取单菌落于此外一种试管中,同样摇荡培养过夜。2、使用仪器恒温培养箱,超净台,恒温摇床，制冰机,台式离心机,小型混
8、合器,冰箱四、实验环节1. 取1.ml DH5培养液倒入1.5mL eppendorf管中,1300p离心1min。2. 反复1。3. 弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 4. 菌体沉淀重悬浮于00溶液中(需剧烈振荡),室温下放置10min。 5. 加入新配制的溶液20, 盖紧管口,迅速温和颠倒epper 管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴mi。 6. 加入10预冷的溶液,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中5分钟,13000rm离心5min。 7. 上清液移入干净eppendrf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),振荡混匀， 1000rpm离
9、心2min。 8. 将水相移入干净eendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)振荡混匀, 30rpm离心in。 9. 将水相移入干净ppndrf 管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下2mi，然后1300离心5mi。10. 弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入m70乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，30rpm离心5min。11. 吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。12. 将沉淀溶于30L TE缓冲液(p.0,含20g/mLR)中,保存在-2冰箱中。 13. 按照同样的流程和措施将pET-的质粒也提出来,保存在-0冰箱中。五、实验成果实验
10、二质粒DNA浓度的测定一、实验目的学习运用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。二、基本原理核酸分子在260nm下有最大吸光值,因此可以通过260下核酸的吸光值计算核酸浓度（m/m)，并通过测定与80nm和230nm的比值，估算NA的纯度。三、实验材料与仪器1、实验材料pEGP-N3和pET-28aA2.使用仪器Ependrf核酸蛋白测定仪，移液枪四、实验环节1. 按下Eppndo核酸蛋白测定仪dsDA,比色皿中加入10l ddH2O，lan空白对照。2. 取一0.5m离心管，吸取质粒DN 5l,然后再加入5l ddO，混匀。3. 将10的溶液转移到比色皿中,注意不要浮现气泡。4. 按下samp
11、l,记录260nm下DNA的浓度（mg/ml）。并同步记录D20m/28nm，OD260n/230nm的比值，估测DNA的纯度。5. 计算质粒DNA母液的浓度=26n下的浓度0（mg/l）,DNA的纯度：O260nm/2801.80.1(如果低于，阐明样品中蛋白质清除的不完全，或样品中有苯酚的污染;如果高于19,阐明样品中R清除的不完全。） OD0nm230 2.0实验三 琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化DN片段的比较以便、省时的技术:琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作措施。二、基本原理影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素重要有：（1）DN分子的大小 双链DNA分子
12、在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越慢,由于摩擦阻力越大,也由于大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2)琼脂糖浓度 给定大小的线状DA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性有关。（3）DNA的构象 超螺旋环状（型)、切口环状(型）和线状（型）N在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率重要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，另一方面是电流强度、缓冲液离子强度和型超螺旋绞紧的限度或密度。某些条件下,型DNA比型迁移得快;在另某些条件下,顺序也许相反。（）所用的电压 低电压时,DA片段迁移率与所用的电压成正比。电
13、场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增长。因此,当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范畴反而减小。要获得不小于2kbDNA片段的良好辨别率，所用电压不应高于5-V/cm。（5)电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的构成和离子强度的影响。缺少离子则电导率减少，DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时(如1bufe），电导率升高,使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化,NA变性。三、实验材料、仪器及试剂1、实验材料质粒DNA2、使用仪器核酸电泳仪，小型混合器,冰箱，蓝盾可见光透射仪四、实验环节1、 %琼脂糖凝胶的配制(1）加2ml TBE缓冲液于三角瓶中,（)精确称取0.2
14、g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，()冷却至60左右,(）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上,（5）将胶板除去封胶带,放入电泳缓冲液（TBE)中,使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1m，轻轻拔除梳子,(6)取5l质粒DA及2l GeneFinder混匀上样(7）50-1v约电泳0.小时（8)蓝盾可见光透射仪观测成果。五、实验成果实验四 酶切及连接1.实验目的学习使用限制型内切酶进行D酶切的原理和措施。2.实验原理迄今已发现了300多种限制性内切酶。老式上将限制性内切酶按照亚基构成、酶切位置、辨认位点、辅助因子等因素划分为三大类。I型酶在其辨认位点之中或临近的拟定位点特异地切开DNA链。它们产生拟定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。5-GAATTC-33-CTTAAG-5II型限制性内切酶中最普遍的是象E I、ind II、mI和Not 这样在辨认序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的重要部分。大部分此类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而辨认的是对称序列；但有很少的酶作为单聚体结合到DNA上，辨认非对称序列。某些酶辨认持续的序列（如o
