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1、山楂中总黄酮的提取及含量测定（吕培银）一、实验目的1. 掌握黄酮类物质的提取方法。2. 掌握分光光度法测定黄酮含量的原理。二、实验原理山楂富含黄酮类化合物，具有重要的生理活性和药效。黄酮化合物的母核由C6-C3-C6即A-C-B三个环组成，A环和B环具有芳香化合物的性质，C环具有黄酮化合物的独特性质。母核中某些位置如C3和C5上含有羟基或具有邻二酚羟基时能与铝、铅等金属离子形成稳定的络合物，这些络合物在光谱上产生明显变化。黄酮与金属离子的这种作用不仅可以用于鉴别这类成分中羟基的位置，还可以作为进行定量分析的基础。本实验利用碱性条件下，在亚硝酸盐存在时，硝酸铝与黄酮进行络合反应，生成红色络合物，
2、且在500nm左右有最大吸收，可利用分光光度法进行测定。因此，本实验采用索氏提取法提取山楂中的总黄酮，并采用分光光度法对其含量进行测定。三、实验用品1、仪器：索氏提取器、平底烧瓶、电热套、量筒、试管、容量瓶、移液管、玻璃比色皿、可见分光光度计等。2、药品：山楂粉末、无水乙醇、芦丁标准品、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等。四、实验内容1、山楂总黄酮的提取精密称取山楂粉末6g,滤纸包好后置于250mL索氏提取器中，加60%乙醇150mL,连续回流提取1-1.5h,冷却，将提取液转移至250mL的容量瓶中，将圆底烧瓶润洗3次，60%乙醇定容至刻度线，摇匀，过滤。取1mL滤液稀释至10mL,摇匀，即为样品
3、待测溶液。2、芦丁标准溶液的配制精密称取芦丁20mg,加入60mL无水乙醇超声使其溶解后，以蒸馏水定容至100mL，摇匀，即得0.2mg/mL的芦丁标准液。3、芦丁标准曲线的制定分别精密吸取芦丁标准液5mL、6mL、7mL、8mL、9mL至10mL容量瓶中，60%乙醇定容后得到浓度为0.10mg/mL、0.12mg/mL、0.14mg/mL、0.16mg/mL和0.18mg/mL的芦丁系列浓度梯度溶液。精密移取各浓度梯度溶液2mL于试管中，再分别加入5%的亚硝酸钠溶液0.3mL,摇匀，放置6min;然后分别加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；最后加入1mol/L氢氧化钠溶液4m
4、L，摇匀，放置15min。以60%乙醇替代标准品溶液作空白，校正基线。在500nm处测定吸光度，并记录数据。以芦丁浓度为横坐标(mg/mL)，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。4、山楂总黄酮含量的测定精密量取山楂总黄酮样品待测溶液2mL于试管中，以60%乙醇代替样品作空白。分别加入5%的亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min;分别加入10%。硝酸铝溶液0.3mL,摇匀，放置6min;最后分别加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL，摇匀，放置15min。在波长500nm处，以空白溶液校正基线，测定样品溶液的吸光度。根据芦丁标准曲线所得的回归方程，计算样品待测溶液中总黄酮的含量。样品平行测定3次。五、数
5、据记录1、芦丁标准液的吸光度表一：芦丁标准液的吸光度管号12345芦丁标准液0.100.120.140.160.18（mg/mL）吸光度0.3850.3990.5150.6250.6442、山楂总黄酮样品待测溶液的吸光度表二：山楂总黄酮样品待测溶液的吸光度管号123吸光度0.5080.5580.545平均值0.537六、数据处理1、标准曲线的绘制图1：芦丁标准曲线y=3.72x-0.0072x=(y+0.0072)/3.722、山楂总黄酮含量的计算:根据芦丁标准曲线所得的回归方程计算山楂中总黄酮的含量(%。)。山楂总黄酮含量()为:CXf/x|/式中:c为样品待测液中总黄酮的浓度(mg/mL)
6、;d为待测液稀释倍数(10倍)；V为样品提取液定容体积(250mL)；m为称取的山楂样品质量(6g)。c=(0.537+0.0072)/3.72=0.15mg/mL山楂总黄酮含量()二(0.15*10*250)/(6*1000)*100%=6.25%七、结果分析本次实验采用索氏提取法提取山楂中总黄酮，测得总黄酮的含量为6.25%o从芦丁标准曲线中能够看出线性关系并不是彳很好，实验过程中存在较大的误差，可以再使用其他提取方法得到的总黄酮含量与该实验得到的总黄酮的含量做一个对比，或者几个人同时做这个实验，最后得到实验结果做一个对比再进行结果分析。山楂总黄酮的提取方法有溶剂提取法、超声波辅助提取、微
7、波辅助提取、酶辅助提取，除此之外，超声波-微波辅助碱液提取、逆流提取、表面活性剂提取、表面活性剂CTMAB-微波协同提取、加压溶剂萃取法提取等，均取得了较好的提取效果1。以山楂总黄酮为研究指标以芦丁为对照品，对山楂的质量控制方法进行了研究采用紫外分光光度法对山楂的总黄酮进行含量测定采用正交试验的方法对山楂总黄酮的提取效果的诸因素(乙醇浓度、加醇量、回流时间及提取次数)进行优选。乙醇浓度为75%，加醇量5倍，回流提取1h，2次提取效果最好2。1 参考文献;维彩云山楂总黄酮提取纯化工艺研究进展J.农业科技与装备,2016:52.付起凤，康毅华,林万里，王博正交法优化山楂总黄酮的提取工艺研究J.中医药信息,2010(03):69-71.
