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1、项目编号：浙江大学医学本科生创新性实验设计申报书项目名称：天麻多糖对离体大鼠胸主动脉的血管舒张作用及其机制 主 持 人： 孙哲思 团队成员： 陈美园、龚潇晨 所在年级专业： 临床医学二系09 所在实验班： 09级生理学实验2B班 指导教师： 王会平 联系电话： 13732254670 电子邮箱： 填报日期： 2012.3.19 浙江大学基础医学系二一一年一月制一、项目成员情况简表项目简况项目名称天麻多糖对大鼠离体胸主动脉血管舒张作用及其机制起止年月2012.3 / 项目主持人姓名孙哲思性别男出生年月1990.11家庭所在省市县浙江嘉善父亲/母亲职业/修读过与科研有关的课程或学术活动时间课程名
2、称学时兴趣程度（高、中、低）2012.2生理学实验教程8高参加科技活动、教师科研与获奖、发表学术论文情况时间研究项目、获奖名称或论文题目项目、获奖级别或杂志名称有机会让你主持一项创新性实验项目的延伸，你会怎么做：首先，要对本项目做深入了解，与组员有良好的沟通；其次，阅读相关文献，了解与本项目相关研究的发展现况，在前人基础上寻找创新点；再次，与项目成员一同设计完善的实验方案，确定分工；最后，共同完成该项目，并总结。项目参与人姓名性别出生年月专业分工陈美园女龚潇晨男二、立项依据（项目的意义、研究现状、原创点、可行性分析、预期结果、工作基础）项目的意义：现代很多治疗高血压的药物西药合成的占了很大比例
3、，中药当中也存在不少有治疗高血压功效的药物，天麻就是其中之一。本项目通过研究天麻提取物天麻多糖的降血压作用及其机制，为中药提取降血压药物提供依据。研究现状：研究人员对天麻的水煎剂和其提取物天麻多糖都有研究，研究发现:天麻钩藤饮可以提高血清游离钙离子浓度.天麻钩藤饮有明显的阻滞血管平滑肌细胞L型钙离子通道的作用,这可能是其降压作用机制之一。【1】天麻水煎剂对主动脉的舒张作用是内皮依赖性的,并与内皮释放的NO有关;也与平滑肌细胞膜上的受体依赖性Ca2+通道和电压依赖性Ca2+通道有关。【2】天麻多糖对RHR大鼠具有良好的降压作用,其作用机制与促进内源性舒血管物质的生成及抑制内源性缩血管物质的释放,
4、最终恢复二者拮抗效应的平衡有关。【3】原创点：已有不少研究证实了天麻的确具有降血压和舒张血管的作用，但是有些研究只是针对整个药剂的作用机制，并非特定成分；有些则在活体RHR大鼠上通过检测内源性舒血管物质和缩血管物质含量的方法研究提取物天麻多糖的作用【3】。但缺乏对提取物天麻多糖内皮和平滑肌作用机制的深入研究。本研究将在离体大鼠主动脉血管上用天麻多糖进行实验，首先研究其内皮依赖性，其次在内皮存在的条件下通过多种内皮舒血管物质阻断剂的预处理，观察主动脉血管是否还会发生舒张；再次研究在除去内皮的情况下，天麻多糖是否引起平滑肌的舒张，若能，则研究其作用机制与K+通道还是与Ca2+通道有关。从而确定是否
5、天麻多糖就是天麻降血压的主要作用成分，并研究其机制。可行性分析：1、已经有不少针对天麻及其提取物的药用研究显示了天麻的确存在降血压和舒张血管的作用；2、生理科学实验室具备实验所需的实验仪器，数据采集仪器，实验试剂，人员；3、药学院可以为本实验提供天麻的提取物天麻多糖，或者通过购买。预期结果：1、 天麻多糖对血管环静息张力无明显影响,但不同剂量的天麻可使苯肾上腺素预收缩血管产生明显舒张.去除血管内皮、10-4mol/L左旋硝基精氨酸(L-NNA,NO合酶抑制剂)或10-5 mol/L甲烯蓝(MB,鸟苷酸环化酶抑制剂)可减弱天麻的舒张作用,但吲哚美辛(环氧酶抑制剂)和普萘洛尔(肾上腺素能受体阻断剂
6、)无影响.2、 另外,在去内皮条件下，对无钙液预孵血管环实验，随着天麻多糖浓度增加，明显抑制CaCl2引起的血管收缩。钾通道抑制剂不能阻断天麻多糖的血管舒张作用。工作基础：通过完成生理学实验15 药物对离体豚鼠回肠的作用 一实验，我们已经掌握了维持离体大鼠主动脉生理特征，滴加试剂以及测量主动脉张力的方法，同时实验室也能为实验提供所需的左旋硝基精氨酸(L-NNA,NO合酶抑制剂)、甲烯蓝(MB,鸟苷酸环化酶抑制剂)、吲哚美辛(环氧酶抑制剂)、普萘洛尔(肾上腺素能受体阻断剂)和钾通道抑制剂。参考文献：1.陈孝银.天麻钩藤饮对SHR血清Ca2+浓度及血管平滑肌细胞钙通道的影响.中国病理生理杂志，20
7、082.张团笑，敬华娥. 天麻水煎剂对家兔离体主动脉血管舒张作用的研究.四川中医，20073. 天麻多糖的降血压作用.高血压杂志，20064.钱安斌.没食子酸丙酯对离体大鼠胸主动脉的血管舒张作用及其机制.浙江大学，20095.钟广伟，李炜.天麻、钩藤、石决明、牡蛎、牛膝混合剂对高血压大鼠血管重构的影响.中华高血压杂志，20086.李亚娟.四种中药提取物舒张血管机制研究.上海中医药大学，20087.董侃，陶谦民. 葛根素的非内皮依赖性血管舒张作用机制.中国中药杂志，2004三、实验设计（实验对象、实验分组、实验方法、观察指标、统计分析等）1.实验对象清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠
8、，体重240一260g，雄性，由浙江大学动物中心提供.2实验方法大鼠胸主动脉环制备迅速游离SD大鼠胸主动脉，置于4含95%O:和5%CO2混合气体预饱和的K一H液中，剔除周围结缔组织，建成3-4mm长的血管环.根据实验需要，采用机械法，用棉签摩擦血管环内表面去除内皮细胞，将部分血管环制备成去内皮的模型.将血管环悬挂于经37预热容量为5m1 K一H液的浴槽内，一端固定，一端通过张力换能器连接RM6240生物信号采集系统.在持续通95%O2和5%CO2混合气体的状态下，逐渐调节其基础张力至2.0g，并在37下稳定60min，其间每15min换液l次.用KCl 60mmol/L刺激达峰值，然后用K一
9、H液冲洗，重复3次，以诱发血管环最大收缩幅度。冲洗待血管环重新稳定后，用 PE 1umol/L预收缩血管环达峰值，加入Ach 10umol/L检验血管内皮完整性，舒张80%以上认为内皮完整，10%以下，认为内皮去除.检验内皮完整性后，血管环用K一H液清洗数次，使其恢复至基础张力.然后以PE 0.1 umol/L或 KCL 60mmol/L诱发最大收缩幅度为 100%，以加入药物后的血管张力幅度与PE或KCL诱发的最大收缩幅度的比率反映血管张力的变化.3.观察指标3.1天麻多糖（PGB）对离体主动脉环舒张功能的作用观察PGB对基础状态血管环张力的影响，观察累积给予 PGB10一1000 umol
10、/L对内皮完整和去内皮血管环的作用;对照组以K-H液代替PGB等容加入.天麻多糖对PE或KCl预收缩血管环张力的实验，以KC160mmol/L或 PE 1umol/L预收缩内皮完整和去内皮的血管环，加入 PGB 10-1000umol/L，观察其对预收缩血管环张力的舒张作用;对照组以K-H液代替PGB等容加入.选择有效浓度进行下一步实验.PGB的血管舒张作用用pD2值衡量，pD2=一logKD，一表示产生最大效应50%时所需激动剂浓度的负对数.pD2值可用于比较不同激动剂对同一受体的亲和力大小.pD2值越大，激动剂对受体的亲和力越大.3.2研究天麻多糖舒血管效应与内皮的关系在内皮完整血管环中，
11、主动脉稳定后，L-NAME组:用一氧化氮合酶(NOS)抑制酶L-AMEO.lmm。比预处理血管环15分钟;吲哚美辛组:用环氧化酶抑制剂引噪美辛10um。比预处理20分钟。再各用 PE0.1umol/L预收缩血管环，观察PGB不同浓度对收缩血管的作用。对照组:以K-H液代替天麻多糖等容加入。3.3离子通道对PGB舒张平滑肌作用的影响用钾通道阻断剂四乙胺(TEA)5mol/L、四氨基吡啶(4-AP)100umol/L、格列本脉(Glib)10umol/L分别预处理去内皮血管环20分钟，观察对PGB舒张平滑肌作用的影响.3.4Ca2+离子通道对PGB舒张平滑肌作用的影响用无钙液 +PE 0.1umo
12、l/L+不同浓度PGB预孵去内皮血管环，按PGB(0，100，300，1000umol/L)分组，观察累积加CaCl2(0.5- 2.5mmol/L)引起血管收缩的程度。用无钙液+KCl 6mmol/L+不同浓度PGB预孵去内皮血管环，按PGB(0，100，300，1000umol/L)分组，观察累积加CaCl2(0.5-2.5mrnol/L)引起血管收缩的程度.4.统计学处理实验结果以xs表示，用 SPSS13.0统计软件处理.采用t检验，ANOVA和Newan-Keuls法进行显著性检验，P0.05为差别有统计学意义，P0.01为差别有显著性意义.参考文献：1.钱安斌.没食子酸丙酯对离体大
13、鼠胸主动脉的血管舒张作用及其机制.浙江大学，20092.张团笑，敬华娥. 天麻水煎剂对家兔离体主动脉血管舒张作用的研究.四川中医，20073.董侃，陶谦民，夏强. 葛根素的非内皮依赖性血管舒张作用机制.中国中药杂志，2004四、实施方案及计划（实验室要求；仪器设备、实验对象、药品试剂、实验材料计划；实验步骤；数据采集与统计等）1实验室要求 环境清洁，实验设备先进齐全，数据收集系统完善，能提供实验所需的物质条件。2仪器设备试剂离体血管环灌流装置及 RM6240生物信号采集系统;天麻多糖，浙江大学药学院提供.去氧肾上腺素(Phenylephrine，PE)，乙酰胆碱(Acetylcholine，A
14、Ch)，左旋硝基精氨酸甲醋(N一nitro一L一arginine methylester，NAME)，吲哚美辛(indomethacin，indo)均为美国sigma公司产品，其他试剂均为市售分析纯.Krebs一Henseleit ( k-H)液(mmol/L:NaCI 118.3， KCI 4.74，k2HPO4 1.18，MgSO4 1.2 N aHCO3 24.9，CaCl2:1.25，葡萄糖11.1，PH值7.4)实验时临时配置。3.实验对象清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重240一260g，雄性，由浙江大学动物中心提供.4.实验步骤4.1大鼠胸主动脉环制备迅速游离SD大鼠胸主动脉，置于4含95%O:和5%CO2混合气体预饱和的K一H液中，剔除周围结缔组织，建成3-4mm长的血管环.根据实验需要，采用机械法，用棉签摩擦血管环内表面去除内皮细胞，将部分血管环制备成去内皮的模型.
