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1、蛋白酶活性检验方法1定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生lug酪氨酸为一个酶 活力单位，以（u/mL）表示。2福林法（第一法）2、1原理蛋白酶在一珲的温度与pH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在 碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。2、2试剂和溶液2、2、1福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na Wo-2H O）100g、钼酸钠（Na MoO-2H O）25g、水 乙乙乙乙700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL,水火沸腾回流10h,取下
2、回流冷却器，在通风橱中加入硫酸 锂（L i2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min,以除去多余的溴（冷后人有绿色 需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄 色，贮存于棕色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。2、2、2 碳酸钠溶液 c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。2、2、3 三氯乙酸 c （CC13COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。2、2、4 氢氧化钠溶液 c （NaOH） =
3、0.5mol/L按GB601配制。2、2、5 盐酸溶液 c（HCI）=1 mol/L 及 0.1 mol/L按GB601配制。2、2、6缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH = 7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（NaHPO-12H O） 6.02g和磷酸二氢钠（NaHPO-12H O） 0.5g，加水溶解并定容至 乙乙乙乙1000mL。b、乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%90%） 10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液称取乳酸钠（70%） 16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L
4、乳酸缓冲溶液。c、硼酸缓冲溶液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。2、2、7 10g/L酪素3）溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴）湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。
5、此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注：3）酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。2、2. 8 100ug/mL L一酪氨酸4）标准溶液a、称取预先于105T干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后 定容至100 mL，即为1mg/ mL酪氨酸标准溶液。注：4） L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。b、 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L 酪氨酸标准溶液。2、3仪器和设备2、3、1 恒温水浴 400.2TO2、3、2分光光度计应符合GB9721的规定。
6、2、4分析步骤4、1标准曲线的绘制a、L 酪氨酸标准溶液按表3配制表3管号酪氨酸标准溶液的浓度 ug/ mL取100ug/ mL酪氨酸标准溶液的体积 mL取水的体积mL000101101922028330374404655055b、分别取上述溶液各1.00 mL （须做平等试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂使用 溶液1.00 mL,置于400.2T水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm, 10mm比色皿， 以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标， 绘制标准曲线（此线应通过零点）。根据作图或用回归方程，
7、计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（ug），即为吸光常数K值。其K值应 在95 100范围内。4、2测定（1）待测酶液的制备a、 称取酶粉12g，精确至0.0002g （或吸取液体酶1.00 mL），用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃 棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研34次，最后 全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液 稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在0.25 0.40范围内）。b、酶粉测定时，稀释倍数参考表A4 （液体酶亦可参照表A4稀释）。表A4酶活单位总倍数第一次稀释第一次稀释2万2
8、0002g 200 mL （100 倍）5 mL 100 mL （20 倍）3万25002g 500 mL （100 倍）5 mL 50 mL （10 倍）4万40002g 200 mL （100 倍）5 mL 200 mL （40 倍）5万50002g 500 mL （100 倍）5 mL 100 mL （20 倍）9、10 万100002g 500 mL （100 倍）5 mL 200 mL （40 倍）（2）测定a、先将酷素溶液放入400.2T恒温水浴中，预热5min ；b、按下列程序操作：试管A （空白）试管B （酶试样，需作三个平行试样）加酶液1.00 mL加酶液1.00 mL400
9、.2C，2min加三氯乙酸2.00 mL （摇匀）加酪素1.00mL （摇匀）400.2C，10min 400.2C，10min加酪素1.00 （摇匀）加三氯乙酸2.00mL （摇匀）取出静止10min，过滤取出静止10min，过滤取1.00mL滤液取1.00mL滤液加碳酸钠溶液5.0mL加碳酸钠溶液5.0mL加福林试剂使用液1.00mL加福林试剂使用液1.00mL400.2C 显色 20min 400.2C 显色 20min于680nm波长，用10mm比色皿于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度测其吸光度c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为300.2C外，其它操作同4、2
10、(2)。标准曲线作同样处 理。5计算X=AxKx4/10xn = 2/5xAxKxn (A3)式中：X样品的酶活力，u/g (u/mL)；A一样品平行试验的平均吸光度；K吸光常数；4反应试剂的总体积，mL ；10反应时间10min，以1min计；n稀释倍数。所得结果表示至整数。6结果的允许差平行试验相对误差不得超过3%。紫外分光光度法(第二法)1原理蛋白酶在一定的温度与jH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素 沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。2试剂和溶液同2。3仪器和设备3、1恒温水浴400.2C。3、2紫外分光光度计
11、应符合GB 9721的规定。4分析步骤4、1求K值按第一法（4、1a）的表A3配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定 其吸光度（A）,并计算K值（其K值应在130 135）范围内）。4、2待测酶液的制备a、称取酶粉12g，精确至0.0002g （或吸取酶液1.00 mL）,以下操作同A242中（1）a ；b、测定酶粉时稀释倍数参考表A5 （液体酶亦可参照表A5稀释）。表A5酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释25万20001g 200mL （200 倍）10mL 100mL （10 倍）810 万40001g 200mL （200 倍）5mL 100mL （20 倍）4
12、、3测定除酶液吸取2.00mL、酪素吸取2.00mL、三氯乙酸吸取4.00 mL外，其它操作条件同福林法测定（4、 2）中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿， 测定其吸光度（A）o5计算X=AxKx8/2x1/10xn= 2/5xAxKxnxE（A4）式中：X样品的酶活力，u/g （u/mL）；A试样溶液的平均吸光度；K吸光常数；8反应试剂的总体积，mL ；2吸取酶液2.00mL,以1min计；1/10反应时间10min，以1min计；n稀释倍数E紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50 ；酸性蛋白酶系数为0.77）o所得结果表示至整数。7结果的允许差平行试验测定值之差不得超过3%。
