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1、-一、做ELISA确定抗原最正确包被浓度，做方阵滴定具体怎么做呢？选择好一份为阳性和阴性背景的标本，将你的抗原用1*CB PH=9.6或1*PB PH=7.4进展倍比稀释8个条件后参加96孔板每孔100ul。一般包被浓度100ng抗原或抗体/孔，最优包被条件需进展试验选择4度过夜取出后甩干，参加20%NBS封闭每孔200ul。37度2h热封，甩去后拍干即可。将你HRP或AP标记的抗原或二抗用酶标稀释液进展稀释倍比稀释4个梯度即可。棋盘滴定就是板酶穿插,同时带上阳性、阴性通过试验确定最正确P/N的包被搭配E的试验2抗原和抗体最正确工作浓度确实定抗原抗体反响要求在最适比例条件下进展，ELISA反响
2、试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进展最正确工作浓度的滴定和选择，以到达最正确的测定条件。1方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释(1:50l:800)后，按行进展包被、洗涤。按列分别参加用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反响后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为08左右，阴性参考血清A值01的包被抗原稀释度为工作浓度。方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度将抗体用包被液稀释为10mgL、lmgL、0.1mgL三
3、个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别参加强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l 000、l:5000、l:10000三个浓度，分别参加每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反响，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值0.1的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最正确工作浓度。二、ELISA最适工作浓度的选择及标准化操作1最适工作浓度的选择11间接法测抗体酶标抗体工作浓度的选择：用IgG进展包被，洗涤。将酶标IgG用稀释液作一系列稀释后分别参加已包被的孔中，保温、洗涤。加酸终
4、止反响后，读取吸光度(A)。读取A值在10时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标IsC的工作浓度应为11600。棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度：用包被液将抗原由1：50开场作比倍稀释后进展包被，洗涤。将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1：100稀释，加样，保温、洗涤。加按工作浓度稀释的酶标IsC抗体，保温、洗涤。加底物显色。加酸终止反响后读取A值。选择强阳性参考血清的A值为08左右、阴性参考血清的A值小于01的包被抗的稀释度作为工作浓度，从中选取最适工作浓度。12夹心法测抗原在夹心ELISA法中，可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。抗体免疫球蛋
5、白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为100、10和01微克毫升，分别在ELISA板上进展包被，每一浓度包括3个纵行，洗涤。在1个横行各包被孔中参加强阳性抗原液，另1横行参加弱阳性抗原液，第3横行参加阴性对照液，保温、洗涤。将酶标抗体用稀释液稀释成3个浓度，例如1：1000、1：5000和1：25000。分别参加每个包被浓度的1个纵行中，保温、洗涤。加底物显色。加酸终止反响后，读取A值。以强阳性抗原的A值在08左右、阴性参考的A值小于01的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选取包被抗体浓度和酶标抗体的稀释度。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再进一步做棋盘滴定。2测定
6、方法的标准化21加样ELISA中除了包被外，一般需进展96孔加样。定性测定中有时不强调加样量的准确性。例如规定为加样1滴，如不具备相当的条件，要尽量使用一样口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积根本一样。在定量测定中，加样量应力求准确，最好采用量程准确的微量移液器。加样时应将液体加在孔底，不要加在孔壁上部，防止出现气泡。22保温在ELISA中，一般在加标本和结合物后，反响的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为防止蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。如用保温箱，空湿盒应预先放在其，以平衡温度。23洗涤洗涤在E
7、LISA过程中不是反响步骤，但却是决定实验成败的关键。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中参加聚山梨酯一类物质即防止非特异性吸附，在ELISA中最为常用。ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：吸干孑L反响液；将洗涤液注满板孔；放置2分钟，略作摇动；吸干孔液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3-4次，有时甚至需洗5-6次。如有专用洗涤机，应设定标准的洗涤步骤，并定期检查洗涤液，保证洗涤质量。24比色阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。在目测法中，待检血清与抗原对照反响孔和待检血清与特异抗原反响孔均呈无色或极浅色，判为阴性；待检血清与抗原对照反响孔无色或极浅色，而与特异抗原
8、呈橘黄色，判为阳性。如用比色计测定结果，其准确性则决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。三、ELISA法抗原包被的浓度如何确定？ELISA法进展抗原包被的时候，抗原包被的浓度是如何确定的。看到有些资料中方阵滴定法，稀释抗原和血清，以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值0.1的条件为最适条件。为什么选择这个为最适条件？弱阳性血清有什么用处？在摸索包被浓度的时候，血清中抗体的含量是固定的吗？需要提前定值吗？急需答案一般我们做的时候抗原抗体两个变量，抗原的浓度是根据你的抗原的纯度来定的，一般纯化的蛋白是2ng，有时候是要抗体的滴度，抗原浓度固定，抗体或者血清就要拉稀释度，这和酶标仪
9、的灵敏性有关.一般OD值在1.0左右酶标仪比拟灵敏，测量的数据比拟准确.OD值如果很深,到达2点几就不灵敏了.所以我们一般选OD值在1.0左右进展分析.之间最正确，当然依据酶标仪的性能而定。个人觉得棋盘ELISA一定要选择OD1.0的点是个误区。首先不同型号的灵敏度应该是不一样的；其次OD为1.0指的是*个抗原抗体浓度条件下的OD值，并不代表通过此次棋盘得到的最正确抗原抗体的浓度所做的各种后续ELISA实验的值也是1.0左右，所以说选择处于酶标仪灵敏度的最正确状况并不一定符合后续的实验。不善表达，不知自己描述清楚没有我自己觉得要根据不同的实验类型间接，双抗夹心或是竞争等来选择最正确抗原抗体工作
10、浓度。象竞争ELISA，做棋盘的目的是包被抗原和一抗的量，试想如果包被抗原太浓，意味着需要竞争抗原浓度也不能小毕竟是竞争对手不能悬殊太大，这就注定了竞争ELISA的检测限不好因为竞争抗原往往是要检测的东西，所需浓度越大IC50也就越大。而一抗也不能足量，否则即能与包被抗原反响又能与检测抗原反响，就不能称为竞争ELISA了。也不能太少，否则整体OD读数太低。双抗夹心ELISA也是同样的道理，找到包被抗体和酶标抗体的平衡点，即能OD与本底之间的平衡点。四、elisa试剂盒Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应
11、用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎HEV病毒 IgM 抗体ELISA检测。一、ELISA简介elisa技术流程ELISA的根底是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体外表的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保存其免疫学活性，又保存酶的活性。在测定时，受检标本测定其中的抗体或抗原与固相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再参加酶标记的抗原或抗体，也通过反响而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。参加酶反响的底物后，底
12、物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进展定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反响的结果，使测定方法到达很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。二Elisa试剂盒测定技术的开展临床测定技术的开展主要在于方法学的开展，而方法学的开展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术开展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的
13、生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。三基因工程试剂对免疫测定技术开展的影响免疫测定技术的根底在于抗原抗体之间的特异结合反响，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的开展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。HBsAg试剂特点检测模式：临床抗体夹心法：包被抗体
14、为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反响性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性99.98%提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说PEIHBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml四测试剂盒检测原理ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品参加孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HE
15、V 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后参加羊抗人IgM-HRP辣根过氧化物酶酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，参加TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反响，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，参加硫酸溶液终止酶和底物间的反响，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。五操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法1.包
16、被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110g/ml。在每个聚苯乙烯板的反响孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。简称洗涤，下同。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反响孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。3.加酶标抗体：于各反响孔中，参加新鲜稀释的酶标抗体经滴定后的稀释度0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反响孔中参加临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37 1030分钟。5.终止反响：于各反响孔中参加2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反响孔颜色
