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1、附件蔬菜中敌百虫、丙漠磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测（KJ201710 ）1范围本方法规定了蔬菜中敌百虫、丙漠磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测方法。本方法适用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敌百虫、丙漠磷、灭多威、克百威、敌敌畏 残留的快速测定。酶抑制（率）法（分光光度法）2原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农 药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显 色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为
2、分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。3.1试剂3.1.1 丙酮（CH3COCH3）。3.1.2 磷酸氢二钾（K2HPO4）。3.1.3 磷酸二氢钾（KH2PO4）。3.1.4 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）。3.1.5 碳酸氢钠（NaHCO3）。3.1.6 碘化乙酰硫代胆碱（C7H16INOS）。3.1.7 pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL水 中，混匀。3.1.8显色剂：分别取160 mg 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和 15.6 mg碳酸氢钠，用 20 mL缓冲溶液溶解，
3、4 C冰箱中保存。3.1.9底物：取125 mg碘化乙酰硫代胆碱，加15 mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4 C冰箱中保存 备用。保存期不超过两周。3.1.10乙酰胆碱酯酶：4 C冰箱中保存备用。3.2参考物质3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、 相对分子质量见表1，纯度均N98%。表1有机磷和氨基甲酸酯类参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量序号中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子质量1克百威Carbofuran1563-66-2C12H15NO3221.252灭多威Methomyl59669-26-0C5H10N2O2
4、S162.233丙漠磷profenofos41198-08-7C11H15BrClO3PS373.634敌敌畏Dichlorvos62-73-7C4H7C34P220.985敌百虫Dipterex52-68-6C4H8Cl3O4P257.443.3标准溶液的配制3.3.1克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准储备液(1000 gg/mL)：冷藏、避光、干燥条件下保 存。3.3.2丙漠磷标准储备液(100 gg/mL)：冷藏、避光、干燥条件下保存。3.3.3克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准中间液A (100 gg/mL)：精密移取上述标准储备液 (1000 gg/mL) (3.3.1)各1mL，分
5、别置于10mL容量瓶中，用丙酮(3.1.1)稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 gg/mL的标准液A。3.3.4克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫、丙漠磷标准中间液B (1 gg/mL)：精密移取标准中间 液A (100 gg/mL) (3.3.3)及丙漠磷标准储备液(100 gg/mL) (3.3.2)各1 mL，分别置于100 mL 容量瓶中，用缓冲溶液(3.1.7)稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 gg/mL的标准中间液B。4仪器和设备4.1恒温水浴锅。4.2天平：感量为0.1 g。4.3分光光度计或相应商品化测定仪。4.4环境条件：温度15 C35 C，湿度W80%。5分析步骤5.1试样的提
6、取5.1.1整株提取法选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g (精确至0.1 g)置于表面皿中， 加入10 mL缓冲液(3.1.7)，残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2 min以上，取上清液 备用。5.1.2整体测定法选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1c:m右见方碎片，称取3g (精确至 0.1 g)放入离心管中，加入10 mL缓冲溶液(3.1.7)，振摇50次，静置2 min以上，倒出提取液， 静置3 min5 min，待用。5.2测定步骤5.2.1对照液的测定先于反应管中加入3 mL缓冲溶液(3.1.7)，再加入适量酶液、0.1 mL显色剂，摇
7、匀后于37 C 水浴锅中放置15 min。加入0.1 mL底物摇匀，立即测定吸光度，3min后再测定一次，记录反应3min 的吸光度值的变化 A0。5.2.2 样品液的测定先于反应管中加入3mL提取液，其他操作与对照液操作(5.2.1)相同，记录反应3 min的吸光 度值的变化小。5.3质控试验每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。5.3.1空白试验称取空白试样，按照5.1和5.2步骤与样品同法操作。5.3.2 加标质控试验5.3.2.1韭菜、芹菜加标实验取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3 g (精确至0.1 g)置于表面皿中，分别加入检 出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B
8、 (1 pg/mL) (3.3.4)，加入10 mL缓冲液(3.1.7)， 残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2 min以上，取上清液备用。其余操作按照5.2步骤同法操作。5.3.2.2油菜、菠菜加标实验取空白试样，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取5份试样各3 g (精确至0.1 g)放 入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B (1 pg/mL) (3.3.4)， 加入10mL缓冲溶液(3.1.7)，振摇50次，静置2min以上，倒出提取液，静置3 min5 min，待用。其余操作按照5.2步骤同法操作。6结果的表述6.1结果计算抑制率(%) =
9、(AA0-AAt) /AA0x100式中：A。对照溶液反应3 min吸光度的变化值；A 样品溶液反应3 min吸光度的变化值；6.2结果判定结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。当抑制率N50%时，表示蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留高于检测限，判定为阳性， 阳性结果的样品需要重复检验2次以上。6.3质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。7结论当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。8性能指标8.1检测限：敌百虫0.1 mg/kg,丙溴磷0.5 mg/kg,灭多威0.2 mg/kg，克百威0.02 mg/kg，敌敌 畏 0.2
10、mg/kg。8.2灵敏度：灵敏度应N95%8.3特异性：特异性应N85%。8.4假阴性率：假阴性率应W5%。8.5假阳性率：假阳性率应W15%。注：1.性能指标计算方法见附录A。2.吸光度变化AA。值应控制在0.20.3之间。具体的酶量，应根据产品说明书上标识的使用量，测/A0值。根 据测定值，增加或减少酶量，使AA。值控制在0.20.3之间。检测卡法9原理样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留经缓冲液提取，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱 酯酶（白色药片）有抑制作用，抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚（蓝 色），从而导致速测卡颜色深浅的变化。通过空白颜色比较，对样品中有机磷和
11、氨基甲酸酯类农药 进行定性判定。10试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。10.1试剂10.1.1 丙酮（ch3coch3）。10.1.2 磷酸氢二钾（K2HPO4）。10.1.3 磷酸二氢钾（KH2PO4）。10.1.4 pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL水中，混匀。10.2参考物质同 3.2。10.3标准溶液的配制同3.3。10.4固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（检测卡）。11仪器和设备11.1恒温水浴锅。11.2天平：感量为0.1 g。11.3环境条件：温度15 C35
12、C，湿度W80%。12分析步骤12.1试样的提取12.1.1整株提取法选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3g （精确至0.1 g）置于表面皿中， 加入10mL缓冲液（10.1.4），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2 min以上。12.1.2整体测定法选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取3g （精确至 0.1 &）放入小离心管中，加入10 mL缓冲溶液（10.1.4），振摇50次，静置2min以上。12.2测定步骤吸取2滴左右待测液于白色药片反应区域，在37 C恒温装置中放置15 min进行预反应，预反 应后的药片表面必须保持湿润
13、。将速测卡对折，手捏3 min或置于37 C恒温装置3 min，保证红色药片反应区域与白色药片反 应区域完全叠合发生反应。每次测定需有一个缓冲溶液的空白对照。12.3质控试验每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。12.3.1 空白试验称取空白试样，按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。12.3.2 加标质控试验取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3 g （精确至0.1g）置于表面皿中，分别加入检 出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（ 1 pg/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样 品同法操作。12.3.2.2油菜、菠菜选取空白试样，擦去表面泥土，剪成1 c
14、m左右见方碎片，称取5份试样各3 g（精确至0.1g） 放入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B（ 1 pg/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。13结果判定白色药片区域不变色或略有浅蓝色为阳性结果；白色药片区域变为天蓝色或与空白对照卡相 同，为阴性结果。通过对比空白和样品白色药片区域的颜色变化进行结果判定。目视判定示意图 见图1。13.1无效白色药片区域干燥，表明取样量偏少，检测结果无效。13.2阴性样品白色药片区域颜色比空白对照卡颜色颜色相当或为天蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲 酸酯类农药残留低于方法检测限，判定为阴性。13.3阳性样
15、品白色药片区域不变色或略有浅蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农残高于检测限， 判定为阳性。阴性 弱阳性 阳性图1目视判定示意图空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。14结论当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。15性能指标15.1检测限：敌百虫0.1 mg/kg，丙溴磷0.5 mg/kg，灭多威0.2 mg/kg，克百威0.02 mg/kg，敌 敌畏 0.2 mg/kg。15.2灵敏度：灵敏度应N95%15.3特异性：特异性应N85%。15.4假阴性率：假阴性率应W5%。15.5假阳性率：假阳性率应W15%。注：性能指标计算方法见附录A。16其他葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、菱白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生 物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，采取整株蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也 可采取整株蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。本方法所述试剂、试
