基因工程复习资料

《基因工程复习资料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程复习资料（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第二章 分子克隆工具酶基因工程工具酶限制性内切酶一一主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化核酸酶一一用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶一一用于DNA和RNA的合成核酸连接酶一一用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶一一用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。第一节限制性核酸内切酶（restriction enzyme）一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3或5 ）,逐个水解核苷酸。 核酸内切酶：从核酸分子内部切断3，5磷酸二酯键。限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类

2、能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。1、细菌的限制修饰现象细菌的限制修饰作用phage x K发现细菌的限制（restriction ）现象：寄主控制的专一性E. coli k1* E.coliB fE.coliB 限制 2dR-M系统的作用:R-M系统是细菌安内御外的积极措施。保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修 饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外

3、源DNA的干扰或噬菌体的感染， 是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶（res trie tion endonuelease）核糖核酸酶是一类能识别双链 DNA 中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧 （endo-deoxyribonuclease）。它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用, 这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。/ 1968 Linn和Arber

4、从E.coli B中发现限制酶I/ 1970 Smith （美）在流感嗜血杆菌发现限制酶II/ 1978 W. Arber，H. O.Smith, Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。/限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。/功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。3 、限制性核酸内切酶的命名若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。墓EEscherichia（属）cocoli（种）RRY13（品系）I首先发现在此类细菌中发现的顺序特性I型II型皿型限制和修饰

5、活性双功能单一功能双功能识别与切割位点分别，随机切 割，相距较远同一位点相距5-10 bp对基因工程中意义无用非常有用意义不大I型限制酶（无用）1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量:30 万 dal 左右 组成:3 种亚基a. 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。b. 修饰亚基:具甲基化酶活性。c. 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需 Mg2+、ATP 和 SAM。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5侧数千碱基处随机切割DNA分子）。II型限制酶（十分有用）1970年，HOSmith和KWWilcox在流感

6、嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量：2万10万dal （较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需 Mg2+。 识别和切割位点：相一致。III型限制酶（无用） 组成：两个亚基a. M 亚基：负责位点的识别与修饰。b. R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子）。二、限制性核酸内切酶识别的序列绝大多数的II型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶

7、序列。 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。矗2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单 链延伸末端。1、限制酶识别序列的长度 （限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为 6个碱基）4个碱基识别位点：Sau3A I! GATC5个碱基识别位点：EcoRlI! CCWGGNci I CC I SGG6 个碱基识别位点：EcoRIGI AATTCHindIAI AGCTT7 个碱基识别位点：BbvCICCI TCAGCPpuMI RGI GWCCY8 个碱基识别位点：Not I GC GGCCGCSf

8、 I GGCCNNNN NGGCC当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现 一个识别位点(44=256，46=4096)。限制性内切核酸酶容称识别序列廉切割短点容称识别序列斥切割点切割后产生5,突出末豔：亍取煖更處于5.GTGATCC.3,極F5.GGTACTC.3,5.ATGAICT.T购T5.CTGCATG.3,T5.GTAATTC.3J购T5.GCATGTC.3,Hind III5J.AEKCTT 宁切割后产生平末希：5.CTCGG.T5,.AGTCT.3,W T5.TGATC.T却Exmc於懸T5.GATT

9、ATC.T5.GGTCC.T切割后产生宙突出末湍：5.CAGTCTC.3?-to 丁5.GGGCCTC.T5.CCCTGGG.T2、限制酶识别序列的结构II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的 旋转对称型回文结构。II类酶识别序列特点回文结构(palindrome)切口 ：平端切口、粘端切口3、限制酶切割的位置DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用(或/表示。 切割的位点：一般在识别序列内部，如G/GATCC、AT/CGAT、GTC ( GAC、C

10、CGC ( GG、AGCGC ； T等。少数在识别序列的两侧，如/ GATC、CATGCCAGG等三、限制酶产生的末端1、限制酶产生匹配粘端若在对称轴5,侧切割底物，DNA双链交错断开产生5,突出粘性末端。5/-GAATTC-3,EcoRl 5，-G-OHP-AATTC- 3，3CTTAAG53CTTAAP + OHG5若在 3-侧切割，则产生 3 突出粘性末端，如 PstI：5CTGCAG-3Pstl5CTGCA- 35G-33-GACGTC- 53G- 5 十 3-ACGT-52、限制酶产生平末端在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产牛平末端，如HaeIII(GG(CC)和EcoRV

11、(GAT； ATC)O3、限制酶产生非对称突出末端许多限制酶切割DNA产生非对称突出末端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbcI，它的识别切割位点如：CC ； TCAGCGGAGT CG1. S1 核酸酶(1) 特点：活性：降解单链核酸(DNA或RNA)为单 核苷酸；降解双链核酸的单链区(2) S1核酸酶的应用-RNA分子的定位2. Bal31 核酸酶Bal31 核酸酶的三种活性：(1) 单链核酸内切(2) 双链核酸外切(3) 双链切口对应链Bal31 核酸酶主要用途：(1) 诱发DNA发生缺失突变(2) 定位测定 DNA 片断中限制性位点的 分布(3) 研究超盘

12、旋 DNA 分子的二级结构3. 其他核酸酶外切核酸酶III (Exonuclease III)： 3至 5 外切RNA 酶 I (RNase I )：切害寸 DNA-RNA 杂合链中的 RNA其他核酸酶:外切核酸酶III (Exonuclease III)： 3至 5 外切DNA 酶 I(DNase I)：随机切割 ss & dsDNARNA 酶 I (RNase I )：切害寸 DNA-RNA 杂 合链中的 RNA4、同裂酶(来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列)同序同切酶、同序异切酶、同功多位等。同序同切酶5、同尾酶G +GATCCCCTAG石Bam H I :TGGATCC_G J.G

13、ATCC CCTAGG CTAGGaTGGATCCCCTAGGA来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后 DNA 分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。BamHl Bell Bglll三种酶可产生相同的5GATC粘性末端(配伍末端)，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性 末端的互补而彼此再连接起来。四、DNA末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求,也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷 酸，否则限制酶难以发挥切割活性。限制性核酸内切酶的活性单位20吐Buffer中，含1聘底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1p g DN

14、A完全降解所需的 酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。五、位点偏爱(Site preference) 对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。六、酶切反应条件 酶切反应系统应组成： 酶、底物和反应缓冲液，并且还需要合适的反应温度。1、 缓冲液：常规缓冲液一般包括提供稳定pH的缓冲剂、Mg2+、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)。2、反应温度：大多数酶的标准反应温度 37 度。3、反应时间：通常是 1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶量。4、终止酶切的方法：EDTA可螯合Mg2+，从而可终止酶切反应；加热。 七、星星活性 ( Star activity )限制性内切酶识别特异性放宽EeoR I在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%,其识别位点发生松动，可 在AATT处发生切割，EeoR I这种特殊的识别能力叫做星星活性，用EeoR I *表示。星星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。影响因素：甘油浓度高12-20%；酶过量(100U/|J l)；离子强度