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1、实验四 动物细胞的传代培养1. 实验目的(1) 了解动物细胞培养的根本知识。(2) 了解体外培养细胞的的根本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的 状态。(3) 掌握动物细胞的传代培养法。2. 实验背景与原理2.1动物细胞培养的根本概念(1) 组织培养：把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中， 使之成活、生长和繁殖。严格乂分为细胞培养、组织培养和器官培养。值得注意 的是和植物组织培养不同,目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的 结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并无严格区别。(2) 原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。通常
2、把 第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。(3) 传代培养：原代培养物长成单层细胞，到达一定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖。注意的是传代的这个“代与细 胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂 35次，不要混淆。(4) 细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。假设其形态均一，生长增殖稳定，生物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞(Certified Cell$。不同种类的细胞成系的难易程度也不同，一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及 癌细胞较容易成系,而神经等细胞那么较难成系。按照其生存期可分为有限细胞系 生存期有限的正常二倍体细胞 和无限细胞系生
3、存期无限的癌细胞、转化细 胞等，大多异倍体2.2动物细胞培养的根本条件体外培养细胞的条件总原那么就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。1营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。现广泛使用的是化学成清楚确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。培养基中还含 有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态。 随着细胞数目的增长，酸 性代谢物增多，培养基变黄。污染的培养物也会使培养基迅速变黄。培养基在使用前还要加血活，它的主要作用有三点：一是提供生长
4、因子、激 素、酶等营养；二是中和有蠹物质，对细胞起着保护作用，尤其可中和培养中使 用的胰蛋白酶的蠹性。第三是提供黏附和伸展因子，是贴壁细胞附壁生长所必不 可少的。所以，血活的品质对细胞的生长有很大影响， 通常换用新的批次的血活 要预先进行血活的筛选实验。一般进口的胎牛血活更有利于细胞的生长，但价格 较昂贵，可根据培养细胞的要求选用。另外，有些细胞培养中还需要添加谷氨酰 胺Gln。2胞外环境条件：主要是温度、气体和 pH条件。这些胞外环境条件应该符合细胞在体内的生长环境。哺乳动物适宜的培养温度是37 C，鸟类是39 C,爬行类是2225C等；大多动物细胞适宜的pH条件都是 7.27.4,以不超过
5、 pH6.87.6为宜。在动物细胞培养过程中随着代谢产物的积累，酸性产物增多, 培养基的pH会下降。因此实验室通常使用 CO2气体体积占5%的空气作为细胞 培养的气体条件，以使 CO2溶解在溶液中形成NaHCOs和H2CO3的缓冲体系， 维持pH的稳定。另外，培养基中参加 HEPES (羟乙基哌嗪乙烷磺酸)可更有 效的维持体系的pH。(3) 无菌：组织培养成功的关键因素之一就是要防止污染，要树立无菌操作观 念，从实验用品、培养基和试剂、操作环境的灭菌消蠹到超净台下的实验操作， 每一步都应该严谨标准。2.3培养细胞的形态 倒谿显微镜：培养细胞用倒谿显微镜观察。倒谿显微镜(inverted mic
6、roscope 组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统在载物台之下。倒谿显微镜优点 为物镜与目镜之间工作距离较长，可直接将培养血,培养瓶等谿显微镜操作台上 进行观察或显微注射等工作，这样物镜可以很接近样品而不会受样品厚度的限 制。通常具有相差物镜。(2)培养细胞的形态特点：体外培养细胞绝大多数都是贴壁生长的。在培养中大 局部细胞都经历由最初脱离机体或瓶壁的立体球形到最终的具有突起的延展细 胞所形成平面单层的形态变化过程。 细胞分裂增殖时同样也经历此变化过程， 才 能附壁继续生长培养细胞的形态变化示意图健康的体外培养细胞的标准是细胞折光性好， 透明；胞质中颗粒少；细胞形 态完整，饱满；伸展性
7、好。当细胞刚刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反 差变大，胞质中颗粒变多，细胞延展性差。随着污染的加重，贴壁细胞脱落，培 养基中杂质多，培养液很快变黄，且混浊。当细胞因未及时传代而缺乏营养时， 细胞也会“变瘦，变圆脱落增多，培养液变黄。(3)体外培养细胞的形态类型：细胞在体外培养时由丁培养条件比拟单一稳定，缺乏体内的生理调节和动态平衡，细胞常失去原有组织细胞的形态特点， 趋丁单 一性，出现“返祖现象。根据它们是否贴附丁支持物生长的特征， 可分为贴附 型生长和悬浮型生长两大类。而贴壁生长乂主要分为成纤维样， 上皮样，多形样 等。成纤维样细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似， 细胞在支持物外表呈梭
8、形 或不规那么三角形生长。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层问质起源的组织细胞 也呈本类形态生长。上皮样细胞具有扁平不规那么多角形特征，细胞紧密相连单层 膜样生长。起源丁内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞 培养时，皆呈上皮型形态生长。悬浮样细胞主要是血液或淋巴液中的悬浮生长的 细胞类型2.4细胞传代培养的一般方法以单层细胞方式生长的细胞分泌细胞外基质和黏蛋白以附着于生长外表。不但不同的细胞系附着于外表的黏附程度有差异，不同状态的细胞这种黏附也有差 异。比方衰老的二倍体细胞通常比年轻的二倍体细胞黏附得更牢固。绝大多数的贴壁细胞需要用胰蛋白酶优先催化碱性氨基酸与邻近氨基酸毯基问的
9、肽键水解， 从而分解粘蛋白、糖蛋白，使细胞脱壁；有些细胞系贴壁不强，只要用吸管吹打 即可使细胞脱落分散，而不需要使用胰蛋白酶；还有些细胞贴壁能力很强需要使 用其他的蛋白酶，比方弹性蛋白酶、链霉素的酶等。为保障胰蛋白酶的最正确活性， 在进行胰蛋白酶处理前应去除血活、Ca2+及Mg2+离子。值得注意的是过度的胰蛋 白酶处理可导致细胞的裂解和活力的丧失。悬浮生长细胞的传代一般只需简单的稀释操作即可。假设需完全更换培养液只需要离心收集细胞后传代即可。3. 实验材料与试剂(1) 材料：MCF-7细胞。(2) 设备与用品：倒谿显微镜，CO2培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，过滤 器及0.22vni的水相滤膜
10、，细胞培养瓶，移液管，吸管，小试管，洒精灯，试管 架等。(3) 药品与试剂：RPMI-1640培养基；小牛血活；0.25%胰蛋白酶(w/v, PBS 缓冲液或D-Hanks缓冲液配制，pH7.4)。强酸洗液的配制：先用约200mL蒸僻水充分加热溶解重铭酸钾 63克，再缓缓参加1L浓硫酸并不断搅拌，充分混合溶解。洗液腐蚀性较强，操作时注意做 好各方面的防护，并且动作要轻柔，注意平安。当洗液的颜色由棕红色变为绿色 时说明已经失效，需重新配制。4. 实验方法与步骤实验内容：体外培养细胞的观察及细胞的传代培养。(1) 培养基等的配制及实验用品的活洗与消蠹配制RPMI-1640培养基及0.25%M蛋白酶
11、(w/v, PBS缓冲液配制pH7.4)溶 液，并过滤除菌后培养验菌。活洗，包装并周压火菌细胞培养的玻璃用品等。细 胞培养的玻璃器也等进行初步活洗后要用强酸洗液浸泡过夜，然后用蒸僻水彻底 冲洗十净；进行湿热灭菌时一般需至少灭菌40分钟；培养过污染细胞的培养瓶那么最好加上用煤酚皂溶液浸泡过夜的步骤；移液管和吸管在包装前要在其管口用细丝或镶子塞上少许棉花，长约11.5cm，松紧要适宜。(2) 动物培养细胞的形态观察倒谿显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍 数。同时可比照观察教师事先准备的污染细胞、死亡细胞，并对培养细胞的密度 有一定感性的认识。(3) 消化：倒掉旧培养基，
12、加几滴胰酶润洗一下，立即倒掉，再加适量胰酶消化12分钟左右，可镜下观察待细胞胞质回缩，细胞问空隙变大时立即停止消化。(4) 悬浮细胞：沿着培养瓶无细胞的一面倒掉胰酶，加适量培养基，用吸管充 分吹打后，镜下观察是否还有贴壁细胞。(5) 分装：一般以1: 2或1: 3进行分装，即一瓶细胞可传为 23瓶。向分装 好的各瓶细胞中再参加适量的含 10% (v/v)血活的RMBI-1640培养液。(6) 拧上盖子(勿拧紧)，做好标记，将培养瓶平放于培养箱中，于37 C, 5%CO2 下培养。5. 实验考前须知(1) 要保证实验中的无菌操作，就必须特别注意一些操作上的细节，比方：培养液等不要过早开瓶；加液时
13、取液用的移液管、吸管勿碰用过的培养瓶瓶口 ；要 勤过火焰，尤其是瓶口 ；手要握在移液器刻度之上的位谿； 超净台中物品的摆放 要合理，尽量防止双手交义取物；假设有动作失误，勿存侥幸心理，应及时更换移 液管等。(2) 对于贴壁细胞的传代培养胰酶的消化步骤是关键，要注意胰酶消化的时间也不能过长，否那么不但造成细胞数目的损失， 也会对细胞造成损伤，使细胞不易 贴壁生长。(3) 可根据细胞的密度，生长速度及实验周期的要求等适当调整细胞的接种密 度。但细胞假设接种密度过低，也会造成细胞生长极为缓慢甚至停止生长。6. 思考题(1) 将传代整个操作过程连贯思考一遍，总结要想保证传代培养的成功，需要 注意哪些环节和细节？(2) 假设细胞消化缺乏或过消化时应该如何操作才能尽可能保证细胞的数目？(3) 假设发现细胞有污染时，为了以后的培养实验，应该做哪些工作？预习问题细胞的原代培养都有哪些方法?
