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1、油橄榄果渣多酚提取实验方案一、 油橄榄果渣预处理（一）油橄榄果渣的脱油1有机溶剂浸提法（油橄榄果渣油的提取工艺及其脂肪酸组成研究） 1.1原料、仪器及试剂原料：油橄榄鲜果渣，用前在-20C冰箱封存。仪器： BS210S 型电子分析天平， DHZ -C 型大容量恒温振荡器， N -1001 型旋 转蒸发仪。试剂：正己烷为分析纯试剂; 实验用水为去离子水。1.2实验步骤准确称取10 g粉碎后的油橄榄果渣，置于250mL具塞三角瓶中，按1:9的料 液比加入溶剂；将三角瓶置于55C（50C ）的恒温振荡器中振荡提取，转速200 r /min （150 r /min）,时间为3h;用过滤法分离溶剂混合物
2、与残渣，用一定量 （5+5mL）溶剂洗涤残渣2次，收集脱油油橄榄果渣，干燥至恒重（真空干燥： 40C, 12h），计算脱油率。2. 酶法（酶法辅助提取工艺对橄榄油品质的影响）2.1原料、仪器及试剂原料：油橄榄鲜果渣，用前在-20C冰箱封存。仪器： BS210S 型电子分析天平， DHZ -C 型大容量恒温振荡器， N -1001 型旋 转蒸发仪、磁力搅拌器（可加热）、高速离心机。试剂：纤维素酶; 实验用水为去离子水。2.2实验步骤准确称取10 g粉碎后的油橄榄果渣，置于250 ml具塞三角瓶中，加入1.0%（ W/W）的纤维素酶水溶液10 ml,置于50C的恒温振荡器中振荡提取，转速 150
3、r /min,时间为45min, 4 000 r /min离心20 min,去上层油脂，收集下层脱油 的果渣，干燥至恒重（真空干燥：40C, 12h），计算脱油率。（二）油橄榄果渣的干燥1. 油橄榄果渣的冷冻干燥1.1 原料、仪器及试剂原料：用上述油橄榄脱油果渣，用前在-20C冰箱封存。仪器： BS210S 型电子分析天平，冷冻干燥机。1.2 实验步骤将原料果渣放入冷冻干燥机，冷冻干燥预冷冻时间为24h，在干燥时间分 别为12、24、36、48h的条件下对样品进行冷冻干燥处理，对所得样品进行粉碎, 选过80目筛的样品进行多酚提取操作，以多酚得率为指标确定最适宜干燥时间。2. 油橄榄果渣的真空干
4、燥2.1 原料、仪器及试剂原料：油橄榄脱油果渣，用前在-20 C冰箱封存。 仪器： BS210S 型电子分析天平，真空干燥机。2.2 实验步骤2.2.1 干燥温度对油橄榄果渣得率的影响将原料果渣放入真空干燥机，分别在温度为30、40、50、60C条件下对样 品进行真空干燥处理12h,然后对所得样品进行粉碎，选过80目筛的样品进行 多酚提取操作，以多酚得率为指标确定最适宜真空干燥温度。2.2.2 干燥时间对油橄榄果渣得率的影响将原料果渣放入真空干燥机，在温度为40C，干燥时间分别为6、12、18、 24h条件下对样品进行真空干燥处理，然后对所得样品进行粉碎，选过80目筛 的样品进行多酚提取操作，
5、以多酚得率为指标确定最适宜真空干燥时间。3. 油橄榄果渣干燥工艺的确定根据以上实验结果，选择最佳干燥方式和条件，作为油橄榄果渣干燥工艺。（三）油橄榄果渣的粉碎1. 原料、仪器及试剂原料：用上述干燥后油橄榄果渣，用前在-20C冰箱封存。仪器： BS210S 型电子分析天平，超微粉碎仪，分样筛（60、 80、 100、 120 目）。2实验步骤将原料果渣放入超微粉碎仪中粉碎一定时间后取出，分别用 60、 80、 100、 120目的分样筛对样品进行筛分，制得不同粒度的果渣样品，对这些果渣样品进 行多酚提取操作（乙醇60%，料液比1： 30, 55C，2h），以多酚得率为指标确 定最适宜的样品粒度。
6、二、 油橄榄多酚的提取（一）溶剂法提取油橄榄多酚1. 实验材料、仪器及试剂材料：经上述预处理的油橄榄果渣，用前在-20 C冰箱封存。仪器：UV754紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂），ZFQ85A旋转蒸 发器（上海医械专机厂），电子天平，高速离心机，100m 1容量瓶（磨口）及配套 的冷凝管，橡胶管，温度计、水浴锅、移液管（5ml、10ml、25ml）、洗耳球、 容量瓶（100m 1）、酒精比重计。试剂：乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、蒸馏水。2. 乙醇浸提法提取油橄榄多酚 2.1 试验方法2.1.1 单因素实验(1) 浸提温度比较试验精确称取l.o g干燥橄榄粉末4份，分别加入70%乙醇
7、30 mL,分别在30、50、 70、90C (20、35、50、65C)下浸提2 h,提取2次，离心，收集上清液，定容 到 100mL。(2) 乙醇浓度比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，分别加入30%、50%、70%、90%乙醇30 mL， 50 C下浸提2 h,提取2次，离心，收集上清液，定容至U100mL。(3) 料液比比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，分别加入50%乙醇10、20、30、40 mL，50C 下浸提2h，提取2次，离心，收集上清液，定容到10 0mL。(4) 浸提时间比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，加入50%乙醇30 mL，50C下分别浸提
8、1、2、3、4h，提取2次，离心，收集上清液，定容到100mL。(5) 提取次数比较试验精确称取1.0 g干燥橄榄粉末4份，加入50%乙醇30 mL，50C下浸提2 h，分别 提取1次、2次、3次、4次，离心，收集上清液，定容至【100mL。以上各处理均重复3次。2.1.2 优化实验根据单因素试验与分析结果，选择有现实作业意义的因素水平构建正交试验表 进行主因素优化试验，并进行统计分析，得出最佳实验组合。3. 丙酮提取油橄榄多酚3.1 试验方法3.1.1 单因素实验(1) 浸提温度比较试验精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，分别加入70%丙酮30 mL，分别在20、30、 50、70C (20、
9、35、50、65C)下浸提2 h，提取2次，离心，收集上清液，定容 到 100mL。(2) 丙酮浓度比较试验精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，分别加入50%、60%、70%、80%丙酮30 mL， 50 C下浸提2 h，提取2次，离心，收集上清液，定容至U100mL。(3) 料液比比较试验精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，分别加入50%丙酮10、20、30、40 mL，50C 下浸提2h，提取2次，离心，收集上清液，定容到10 0mL。(4) 浸提时间比较试验精确称取1.0g干燥橄榄粉末4份，加入50%丙酮30 mL，50 C下分别浸提1、2、 3、4h，提取2次，离心，收集上清液，定容到10
10、0mL。(5) 提取次数比较试验精确称取l.Og干燥橄榄粉末4份，加入50%丙酮30 mL, 50C下浸提2 h,分别 提取1次、2次、3次、4次，离心，收集上清液，定容到100m L。以上各处理均重复3次。3.1.2 优化实验根据单因素试验与分析结果，选择有现实作业意义的因素水平构建正交试验表 进行主因素优化试验，并进行统计分析，得出最佳实验组合。4. 最终提取方案确定根据以上实验结果，选择最佳提取溶剂和提取工艺，作为超声波和微波处理法 提取油橄榄果渣多酚的辅助提取方法。（二）超声波法提取油橄榄多酚1实验材料、仪器与试剂材料：经上述预处理的油橄榄果渣，用前在-20 C冰箱封存。仪器：UV75
11、4紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂），JY88II超声波 细胞粉碎机（上海新芝生物技术研究所）。试剂：蒸馏水、乙醇或丙酮（分析纯）2. 单因素试验2.1 超声波功率对油橄榄果渣多酚提取效果的影响称取1.0g经上述果渣预处理后的油橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂 和提取方法加入最佳溶剂，分别在功率为60、70、80、90W，提取时间25min的 条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出最佳的超声波提取功率。2.2 超声波时间对油橄榄果渣多酚提取效果的影响称取1.0g经上述果渣预处理后的油橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂 和提取方法加入最佳溶剂，在功率为80W，提取时间分别为1
12、5、25、35、45min 的条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出最佳的超声波提取时间。（三）微波处理法提取橄榄多酚1实验材料、仪器与试剂材料：经上述预处理的油橄榄果渣，用前在-20 C冰箱封存。仪器：UV754紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂），Galanz中型机械微 波炉（顺德格兰仕电器有限公司）。试剂：蒸馏水、乙醇或丙酮（分析纯）2. 单因素试验2.1 微波功率对油橄榄果渣多酚提取效果的影响称取1 .Og经上述果渣预处理后的油橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂 和提取方法加入最佳溶剂，分别在功率为260、270、280、290W （改为200、400、 600、800W）
13、，提取时间5s的条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出 最佳的微波提取功率。2.2 微波时间对油橄榄果渣多酚提取效果的影响（橄榄中黄酮微波提取工艺研 究）称取1.0g经上述果渣预处理后的油橄榄果渣粉，按上述溶剂提取法中最佳溶剂 和提取方法加入最佳溶剂，在功率为280W，提取时间分别为4、5、6、7s （改为1、5、10、15min）的条件下进行油橄榄果渣的提取，根据多酚得率选出最佳的 微波提取时间。（四）油橄榄果渣多酚提取最优工艺的确定 根据以上实验结果，以油橄榄果渣多酚得率为指标，确定油橄榄多酚提取的最 佳方法以及工艺条件。三、油橄榄多酚的分离纯化（油橄榄叶中多酚和黄酮的含量分析） （
14、一）大孔树脂法1 树脂的筛选通过测定以下型号树脂LX-1、XAD-7、XAD-16、AB-8、HPD-200、LS-100 的吸附和解析能力确定树脂。2树脂的动态试验（橡实壳多酚分离纯化、抗氧化剂抑菌的研究（中南林业科 技大学 郑菲 硕士论文）2.1 吸附动态试验（1）pH值对吸附的影响（3、4、5、6、7、8）（2）上样量对吸附的影响（1、 2、 3、 4、 5BV/h）（3）动态吸附曲线的绘制2.2 解析动态试验（1）乙醇浓度对洗脱效果的影响（30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%）（2）洗脱剂的体积对洗脱效果的影响（1、 2、 3、 4、 5BV/h）（3）动
15、态解吸曲线的绘制取干燥好的油橄榄果渣30g,采用最佳提取工艺进行提取，将提取液在30C 下旋转蒸发除去溶剂，回收溶剂，浓缩后样品加水稀释至100 mL,用石油醚等 体积萃取3次，石油醚层浓缩，回收石油醚，水层上大孔树脂柱;2. 0 amx50 cm） 进行柱层析。柱层析方法如下：取处理好的250 mL D101大孔树脂，装入层析柱 内。样品溶液慢慢滴人层析柱，漏出液的速度为4 mL/min。用23倍柱体积的水 淋洗树脂至流出液呈无色，以洗去其中的多糖等水溶性杂质，再用70 的乙醇 溶液600 mL缓缓通过树脂柱，控制其流速，收集洗脱液。30C下旋转蒸发除去 乙醇，水相冷冻干燥，得油橄榄叶提取物精制产品，于-20C下保存备用，测定 多酚的含量。（称取1 /4、1/5精制产品分别定容至25mL）四、油橄榄多酚的分析鉴定：紫外吸收光谱、红外光谱、高效液相色谱 1.初步定性分析：香草醛-盐酸法、明胶试验法（橡实壳多酚分离纯化、抗氧化 剂抑菌的研究（中南林业科技大学 郑菲 硕士论文）2、UV分析：以甲醇溶剂为参比，在190900 nm范围内测定提取物质的紫外吸 收光谱。3. HPLC色谱分析条件：色谱柱Zorbax SBC，8（94. 6 mm X 250
