细菌生长曲线

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1、驗六細菌生長曲線之測定 Exp 11. Turbidity of bacteria一、目的： 在進行細菌生長曲線之測定前，必須先了解 U-2001 Spectrophotometer 操作方法，才能將細菌的數量以吸光值的方式表示出來。二、原理：請詳讀整理 p. 90-92，學會調整 Optical density （O.D.）【Exp 13.會 用到】。三、器材：1. culture :（每組）24 hr Escherichia co（blrioth）2. medium： （每組）Nutrient broth3. equipment ：1 ml pipette , pipette aid ,

2、cuvette，拭鏡紙，廢菌液杯，裝蒸餾水的洗 瓶，滅菌空試管， U-2001 Spectrophotometer ，振盪器。四、實驗步驟 由助教先示範操作方法，再由學生自行操作與測量待測液之吸光值。1. 了解 U-2001 Spectrophotometer 操作方法：a. 溫機約 15 分鐘。b. MENU （主目錄）選 1. Photometer 輸入波長 600 nm 及 ABS Forward c. Nutrient broth 歸零 autozero （前、後二支 cuvette） 1d. 取出後面之cuvette，倒入待測液2 ,等到右上方數據穩定後，按下Start 記錄。1 c

3、uvette 有石英管 （測波長 340 nm 以下）、玻璃管、塑膠管等材 質，本實驗使用塑膠材質之比色管。2 每次測定前需先用蒸餾水滴洗 cuvette ， 再以待測液潤濕，倒 掉， 再裝入 待測液，測完倒掉，用蒸餾水滴洗。測定之前 cuvette 須用拭鏡紙擦乾，手握管的非透明處；廢菌液請滴洗入 廢菌液杯中，集中處理) 。2. 每 組 取 一 管 助 教 所 準 備 之 E. coli 當 待 測 液 ，實際 演 練 U-2001 Spectrophotometer 操作，測出其原液 O.D. 【Exp 13. 將會利用到此操 作，故須熟悉其操作步驟】 。 Exp 12. Serial D

4、ilution-Agar Plate Procedure to Quantitate Viable Cells一、目的：1. 學習連續稀釋法。2. 觀察活菌數。二、原理：微生物數目之計數法有：1. 直接顯微鏡計數 (Direct Microscopic Counts) ：以 Petroff Hauser chamber 計數。僅計數微量菌液，再由數學方 法求取總菌數，此法迅速方便但活與死菌皆涵蓋之且總菌數若 低於一百萬時，準確度差。2. 電子細胞計數器(Electronic Cell Counters):如 Coulter Counter , 此法不能區分活或死菌，也無法區別惰性顆粒物質與細胞

5、物 質。3. 化學方法(Chemical Methods):以間接測定蛋白質濃度、DNA 產量、細胞質量及代謝物等反推菌數。4. 分光光度計分析(Spectrophotometric Analysis)：利用穿透菌液之 光線量，隨菌量增加而減少。此法迅速但菌數若低於一千萬 時，敏感度差。5. 連續稀釋-洋菜平板法 (Serial Dilution-Agar Plate) :此法乃計數活 菌。利用無菌水對菌液做一連串稀釋，採Pour Plate法進行之， 經隔夜培養後計數(或者使用Quebec，參考課本Figure 21.4, p. 89)。本實驗課中繪製細菌生長曲線之方法便是利用連續稀釋-洋菜

6、平板法，故Exp 12與細菌生長曲線之測定一併進行。 Exp 13. The Bacterial Growth Curve一、目的：了解細菌的族群生長變動，繪製生長曲線(growth curve)，並求出增代 時間 (generation time)。二、原理：a. 細胞的生長：將細菌接種在液態培養基中，置於其最適環境下 (最適 溫度、pH及氣體組成)培養，則可求出一細菌生長曲線。細菌之生 長曲線可分成以下數個時期：1. 遲滯期(lag phase):細胞正在適應新環境，數目無明顯增加。2. 對數期(log phase):細胞生長快速，數目呈幾何級數增加。3. 靜止期 (stationary

7、phase) :因養分耗盡、代謝廢物的堆積，細胞分 裂與死亡速度相當，故其數目不增加。4. 死滅期(death phase):細胞快速死亡，數目呈幾何級數下降。b.生長曲線之測量：可用pour plate法，直接求得活細胞數目，或是用 分光光度計讀值法，間接推測細胞生長量。之後在半對數方格紙上 作圖。c.generation time 的計算:1. 較粗略的計算 (分光光度計結果)GT 二 t(O.D. 2n)GT: generation timet (O.D. n)2.直接細胞數目的計算(pour-plate之結果):GT二t log 2log b log BB :在 log phase 上

8、一點的細胞數目。 b :在log phase上另一點的細胞數目。 t: B 點與 b 點的間隔時間。三、器材：1. culture :（每組）12 hr Escherichia coli2. medium:100 ml BHI 1 瓶 （棉花頭三角瓶）99 ml 無菌水 18 瓶 （稀釋牛奶瓶）400 ml NA 1 瓶（放於 50C Water Bath 中）3. Equipment :（每組）37C shaker incubatorU-2001 spectrophotometerpetri dishes 24 個 micropipettes1 ml 與 200卩1 micropipette

9、 tips （滅菌盒中） 滅菌空試管 6 支 cuvette 1 支安全吸球10 ml sterilized pipettes 6 支 計時器（自備）、廢菌液杯、拭鏡紙、裝蒸餾水的洗瓶、振盪培養箱。四、實驗步驟1. 標示工作:（班別、實驗組別、日期）.無菌水：t10-4，10-60故共30有t60，t90，t120，6x3 = 18 瓶）150（每個 t 有 3 個稀釋度即 10-2，b. petri dishes :每個 t 標示有 10-4 , 10-5 , 10-6 , 10-7 故共有 24 個。2. 流程:（參照 Fig. 21.1）1a.取 5 ml 的 log phase E.

10、coli culture 到 100 ml BHI broth，測 600 nm下之O.D.值，記錄之並登錄於黑板。（為t0）lb.取1a. 0.1 ml到9.9 ml無菌水稀釋瓶中t0 , 10-2。lc.取1b. 0.1 ml到9.9 ml無菌水稀釋瓶中-t： , 10-4。ld.取1c. 0.1 ml到9.9 ml無菌水稀釋瓶中t0 , 10-6。 1b.1d. mixing sample 的方法請參考課本 Figure 21.3, p. 89。使用安全吸球請小心，玻璃pipettes及pipette tips用完後請分別丟 入回收桶中,待下課後一併滅菌清洗或丟棄。2a. 取 1c. 1

11、 ml 做 pour plate 1 t0, 10-4。0.1 ml 做 pour plate t0, 10-5。2b.取 Id. 1 ml 做 pour plate t0 , 10-6。0.1 ml 做 pour plate t , 10-7。完成2a.的plate待凝固倒置培養37 C, 24hr後記錄菌數並登錄於 黑板2。3. 當1a.已做完1b.放入shaker 120 rpm 37C, 30分鐘（為t际。4. 測 O.D.。 （記錄之並登錄於黑板） 4305. 重覆 1b.2b.6. 重覆3.（為t ）7. 其它 t , t60, t 依此類推。90 120 150 100 ml B

12、HI三角瓶，每一次完成30分鐘的培養後，於測O.D.前， 可先取出5 ml於滅菌空管中，三角瓶馬上再放入 shaker incubator 中 培養，以節省時間，之後再分別進行測 O.D. 及稀釋工作。廢液丟在 稀釋過不用的牛奶瓶中。海1倒plate時，培養基量約2/3圓面積，倒完馬上蓋蓋子並前後左右各 輕搖 3 次，使 培養基充滿於 petri dish 底部，但需小心勿將培養基 搖出碰到蓋壁。鸟菌數若為TNTC或TFTC也請算出約略菌數。（一個plate可接受菌 落菌數在 30 - 300個之間）彳100 ml BHI三角瓶的culture，需於放入shaker incubator後才能開

13、 始計時。彳O.D.若 0.6請稀釋再測，稀釋倍數需記錄。（O.D.值在0.10.6 之間較可信，為在線性範圍內） 5 cuvette 回收。 實驗後的觀察注意事項：1 .實驗結果之紀錄法：TNTC （too numerous to count） ：每個 plate 菌落數大於 300 個，請畫 區域約略算出菌數， 登記如下： TNTC （1256）。TFTC （too few to count）:每個plate菌落數小於30個，請算出菌數， 登記如下： TFTC （12）。每個培養時間點須至少有一個plate菌落數在30-300內，如t30的10-6 稀釋度有40個菌落則登記為40X106，若有二個plate菌落數在30300 內則須明列出，並於括號內記錄平均值。2. 每個plate上的菌落，不管大小皆算是E. coli3. 若 plates 的 colony 數目在 30300 內則須用麥克筆在背面點算詳細， 若超過此範圍才可以畫區域倒推算出約略數目，如此可以知道是否 菌數有隨培養時間增長而增加，但登記在結果表中時只須記錄30300的plate即可。4. 每毫升菌液有多少菌數算法請參考課本p. 90的例子5. plates算完後，請放到8A桌待滅菌。