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1、trans-SNARE复合物参与了几乎所有已知的发生在细胞内部的融合反应，其作用为使囊 泡膜上的v-SNAREs与靶膜上其互补物t-SNAREs结合。而融合过程中所需SNARE复合物 的数量以及外加蛋白是否为胞内发生的膜快速融合所必需还不清楚。膜上携带突触的/内吞 作用的v-SNAREs VAMP/小突触泡蛋白的单囊泡能与包含有突触的/内吞作用的t-SNAREs 突触融合蛋白-SNAP25的二维的、有支持作用的磷脂双分子层迅速融合。当每个囊泡膜上 外向型v-SNAREs的数量低于5-10时囊泡的融合速率明显下降，所以将其作为囊泡融合所 需最低指标。从囊泡接触到融合这一过程所学要的时间与5-11
2、个t-SNAREs完成融合的时 间一致，与v-SNARE的需求量一致。胞内蛋白质的运输一一以及激素、神经传导物质等的分泌一一依赖膜融合。细胞内的膜 融合反应机制为囊泡上的的 v-SNAREs与靶膜上的同源t-SNAREs结合形成四螺旋束(SNARE针)，形成的四螺旋束使邻近的双分子层发生融合。在细胞中，SNAREs受到辅助 蛋白的调节，有些辅助蛋白，如Secl/MunclS样蛋白家族是真核生物膜融合过程中必需成 分。当没有调节蛋白或多肽存在的情况时SNAREs是否能够单独促进膜融合仍有很大争议。 而且膜融合过程中需要多少SNARE针也还不清楚。在体外研究单个囊泡从对接到融合的过 程发现，在没有
3、任何辅助蛋白存在的情况下，5-10个SNARE针能够介导快融合的发生。在进行SNARE介导的膜融合研究中，再造的膜融合试验发挥着很重要的作用。让融化 的双分子层形成小的单层囊泡(SUVs)，然后用慢动力学方法将SNARE蛋白结合到SUVs 膜上。如今已经能将单 SUVs (膜上有 synaptic/exocytic v-SNAREs VAMP/synaptobrevin)与 二维的、支持的双分子层(SBLs)(膜上有 synaptic/exocytic t-SNAREs syntaxin1-SNAP25) 融合，并且该融合反应发生的时间在10-100ms到数秒之间。然而,t-SNARE的亚单位
4、SNAP25 却不是必需的，或其需要人工肽段的辅助，这就使得这些结论的生物关联变得更加模糊。本 研究以及其他有关SNARE介导的膜融合的研究中，使用只有具催化酶存在的脂质双分子， 该酶具有催化膜融合的活性。事实上，自然条件下的细胞膜上存在多种蛋白，其浓度30,000 40,000/p m2，使膜融合的环境完全不同于体外融合，这就使得SNARE蛋白在介导磷脂 双分子层融合的过程中，必须将无关蛋白排除。为了更好的模拟体内融合的过程，我们对双分子层进行了处理：将PEG链连接到磷酸 酰乙醇胺上，从而在双分子层表面形成高度约4nm的PEG多聚物刷。实验中使用摩尔浓度 为5%的PEG，使膜表面多聚物链的浓
5、度约为70,000/p m2,体积为6070nm3，与细胞溶 质中5060kDa叠球状蛋白值一致。我们发现SNAP25的依赖性得到修复，但是仍存在快速 融合现象。研究中，提前使用PEG刷为双分子层提供立体保护，保证配体受体反应顺利进 行。PEG化的SUVs是已知的最稳定的脂质体，由于其绝佳的生物相容性，在给药中作为 “隐形脂质体” PEG链同时也赋予了脂质双分子层其他的稳定性。含有PEG刷的SBLs干 燥后在空气中保存的时间多于1天，且再水化没有明显失去其完整性，仍具有原来流动性。 另外，显微镜下观察PEG链使双分子层离盖玻片产生大约4nm,而这一距离能够显降低跨 膜蛋白与潜在的、损害跨膜蛋白
6、径向扩散的底物之间的反应。结果除了 PEG刷，在SBL中加入荧光脂质也能加强SUV-SBL融合。实验时，光漂白处理 后必须给予一个简单的荧光恢复，下调至SBL的衍射极限来保证SBL的连续性和流动性。实验设计基于特定的微流体流动系统，在这个系统中荧光标记的v-SUVs以可控速率流 动，浓度高于SBL，在荧光显微镜下定量测定人为稳态下膜融合速率。低囊泡浓度下，我 们能够很好地观察单个囊泡与SBL接触、融合的过程，而不需要借助荧光显微镜从那些已 经发生连接的囊泡中辨别囊泡，这大大方便了我们检测融合的绝对效率以及从接触到融合所 需的时间。在普通的载玻片上做两组平行的微流体流动链，这时我们可以清楚地对比
7、这两组 不同的反应环境。小体积的微流体链(lp L)的使用，使整个实验可以在最低的恒定的SUVs 流速下进行。这一流速还有助于冲洗掉与膜结合松散的无特殊键的v-SUVs、维持一个恒定 的v-SUV浓度以及促进分析。在亲水玻璃基板上的微流体流动链中，通过对包含SUVs的t-SNARE的温育来合成有 支持作用的双分子层。双分子层合成之后用大量的缓冲液冲洗并进行SBL的质量检测，然 后在 脂质标准浓度为4060 nM、恒定流速为23p L/min的条件下，链中加入LR-PE标 记的v-SUVs。v-SUV的平均直径约为50nm,如果假设每个脂质所占的面积为0.7 nm2， 这就相当于2 3 pM v
8、-SUVso流体的作用会使大量的SUVs在膜上出现条痕状分布，而在 没有大量SUVs干扰的情况下，通过极微量的SUVs浓度，我们可以检测膜处在接触还是融 合的状态。图一 D显示了 X条件下但囊泡接触到融合的过程。D框中显示囊泡接触，F框中显示 融合，接触到融合的时间为300ms。融合信号来自v-SUV与膜融合之后SBL上荧光脂质发 出的射线。图一 E是对该射线的量化，图一 E中是相应时期的荧光高斯图。数据的变化程 度用方差来表示，从图中可以看到，在膜融合之后方差随时间呈直线上升，这与我们的猜想： 信号从集中的一点开始慢慢扩散至混乱相一致。因为O 2 = 2Dt ,由此可以得出融合后期脂 质扩散
9、系数为D =3.35 0.53 p m2/s，该数据有力地支持了 FRAP的测量数据，并且在高 品质的、PEG作为缓冲液的SBLs体系中，脂质扩散率要高。相比之下，在缺乏PEG脂质 的SBLs中脂质扩散率要低3-4倍。图1F中显示的是振幅峰值和总强度随时间变化的关系： 强度的轻微上升说明脂质融合之后，膜上LR-PE的浓度变小，所以荧光有轻微的淬灭。图2A显示的是融合过程中的若干情况。由于v-SUV密度低、SBL t-SNAREs的消耗需 要数小时，所以在反应发生的前30分钟内融合的速率不会明显减少。图2A中的斜线表示 可能的融合速率。同样的v-SUVs与不含蛋白的SBLs的实际融合速率极低。图
10、2B中显示 的是所有根据实验得出的平均融合速率。当实验体系中没有v-或者t-SNAREs时，膜不融合；使用破伤风神经毒素裂解v-SUVs上的Syb之后，膜融合被有效阻滞；此外，膜融合还 可以被可溶性v-SNAREs阻滞。因此，在以上实验体系中SNARE复合物的装配是驱动膜融 合的重要因素。在融合过程中，对囊泡之间的接触也进行了同样的研究。囊泡完全接触的平均速率(dt t ) tot 大约是融合速率的两倍，表明接触后有50%发生融合。大多数发生接触的囊泡在接下来的 20-30s内没有继续融合，而是逐渐地被光学漂白，之后可能停留在接触状态。只有约4%明 显地从SBL分离出来，再回到微流体中。A h
11、alf-time of 2000 - 3000 s，f、d 开始下降； tott 5000s且v-SUV L:P = 150 - 200时f、d 回到初始水平。这可能是融合的v-SUVs呈递totv-SNAREs，进而自由状态的v-SNAREs消耗SBL t-SNAREs的结果。v-SUVs包含更高的 Syb复制数，使得每次的融合过程中有更多的Syb释放到SBL中，进而导致f下降很快， 这一事实也证实了上面的推论。该事实又进一步暗示在SBL中，t-或者v-SNAREs、或者两 者同时可以移动，有时还能够构建无活性的cis-SNARE复合物。在SBLs中，对t-SNARE浓度的依赖性为非线性关系
12、。当t-SNARE浓度从t-L:P = 30,000 上升到10, 000时f只轻微上升；浓度更高时，则迅速下降。本研究范围内，f与v-SUV浓 度呈线性关系。大多数情况下，膜接触之后立即发生融合。图3A、3B的数据显示从接触发生到融合的 平均间隔时间为130ms左右。15-25%的膜融合需要相当长的时间间隔。长时间间隔后同样 有一段时间间隔，这段时间内v-SUVs与无蛋白的SBLs接触和融合，这说明在整个融合过 程中可能存在一个小的、无特异性的成分。对时间的分辨不够高，可能导致快的时间间隔被高估，尤其是在高t-SNARE密度时， 时间隔更短的情况下。为了避免这样的错误在t-L:P = 10K这组实验中我们改变了收购时期求出表观平 dcq均间隔t W 0.8 s如图3A、3B,绘成
