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1、细胞因子蛋白含量（Lowry法）测定标准操作规程依据：中华人民共和国药典2005年版第三部。范围：适用于细胞因子原液的检定。目的：检测细胞因子原液的蛋白质含量。原理： lowry法是在双缩脲反应的基础上发展起来的。是由试剂A和试剂B二部分组成。试剂A是碱性铜试剂；试剂B含有磷钨酸和磷钼酸。在碱性条件下，蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色的蛋白质与铜的复合物，然后此复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原试剂B中的磷钼酸-磷钨酸，产生深兰色，为钼兰和钨兰的混合物，其呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，可用比色法测定蛋白质浓度。内容：1 材料11样品：经二人核对好批号后测定。12试剂钨酸钠 Na2WO
2、42H2O 化学纯钼酸钠 Na2MOO42H2O 分析纯磷酸 H3PO4 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯硫酸锂 Li2SO4 分析纯酒石酸钾钠 C4H4O6KNa4H2O 分析纯硫酸铜 CuSO4 分析纯氢氧化钠 NaOH 分析纯无水碳酸钠 Na2CO3 分析纯溴水 Br2 分析纯13标准品：由中国药品生物制品检定所提供。14注射用水：符合中华人民共和国药典2005年版要求。15其它材料：试管架、吸球、硫酸纸、药勺、记号笔、玻璃比色杯。16仪器、设备紫外分光光度仪,UV-265扭力天平，TN100B冰箱，BOD-170A17器皿试管、量筒（250ml、100ml）、玻璃瓶（500ml、250ml
3、）、棕色磨口瓶（50ml、500ml）、吸管（1ml、5ml、10ml），以上均由本室洗刷组处理干净。2 方法21准备工作211工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。212调试仪器设备2121紫外分光光度仪，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。2122扭力天平，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。2123冰箱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。213试剂配制2 1 31试剂A：用扭力天平准确称取20克Na2CO3溶于500ml 0.2mol/L NaOH溶液中，另将1克CuSO45H2O溶于100ml 2%酒石酸钾钠溶液中，临用前将二种溶液按5
4、0：1的比例在250ml洁清的玻璃瓶中混合均匀，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期。放置30分钟，即为试剂A。2132试剂B：在2升磨口回流蒸馏器中，向烧瓶中加入钨酸钠（Na2NO42H2O）100克，钼酸钠（NaMO42H2O）25克 ，蒸馏水700ml，85%磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混匀后接通回流凝管，沸腾后文火回流10小时，冷却后加硫酸锂150克，蒸馏水50ml及数滴溴水，摇匀，取下回流冷凝管，开口继续沸腾15分钟，以驱走过量的溴，此时溶液为金黄色，冷却后用蒸馏水定容至1000ml放棕色瓶中4冰箱保存，回流整个过程应在通风橱中进行，使用时2倍稀释。二人
5、复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2133 0.2M NaOH：用扭力天平准确称取NaOH 0.8克，加注射用水至100ml，配好后的液体放250ml洁净的玻璃瓶中，盖上胶栓，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，室温备用。2134 2%酒石酸钾钠：用扭力天平准确称取酒石醋酸钾钠2克，加注射用水至100ml，配好后的液体放入250ml洁净的玻璃瓶中，盖上胶栓，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，放4冰箱备用。22具体操作步骤221摘下设备上的“备用”标志，挂上“运行”标志，设备的详细操作参见设备标准操作规程。222
6、取洁净干燥的试管若干，分成二组按下表进行操作。表1 试管编号处 理123456789101112标准溶液（ml）0.00.20.40.60.81.0Dd H2O（ml）1.00.80.60.40.20蛋白质（mg/ml）试剂A（ml）5.05.05.05.05.05.0充分混匀，室温（2025）放置十分钟试剂B（ml）0.50.50.50.50.50.5迅速混匀，室温放置30分钟，以1、2管为空白，打开紫外分光光度仪，挂上“运行”牌，在波长650nm处比色测定。223标准曲线的绘制，将测得的两组平均OD值和对应蛋白含量值输入紫外分光光度仪中，建立回归方程，画出回归曲线，即为标准曲线。224待测
7、样品蛋白质的测定，样品蛋白质浓度的测定过程同4.2.1项方法。表2样品批号管号OD650稀释倍数蛋白含量结果（平均值）225将所使用的仪器关闭，拔下电源。226场地摘下“使用中”的标志牌，挂上“待处理”标志牌。3 结果的判定31判定标准取二组测试样品的OD650平均值，输入回归方程所得的结果乘以稀释倍数，即为测试样品的实际蛋白质浓度。32判定结果、填写记录：测定结果经二人复核并填写纪录。4 清场41称药后将药品瓶盖盖紧，放回原处。42将扭力天平复位，砝码放回原砝码盒，将天平清理干净后放回原处，挂上备用牌。43用过的玻璃器皿用纯化用水洗干净后返回洗刷组。44检查是否关闭所有仪器开关，拔下电源。45将玻璃比色杯用纯化水清洗干净后放回原处。46将仪器的“使用”牌取下，挂上“备用”牌。47用拖布擦净地面，用抹布擦净工作台。48填写清场记录。49清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”牌，挂“清场合格”标志牌。5 注意事项在试剂B的配制过程中，蒸馏烧瓶必须冷却后再加硫酸锂，否则试剂容易溅出。
