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1、word分子生物学实验实验报告实验名称： 蛋白印迹技术 某某：杰学号：3140104666 序号：25同组同学：唐曦带教教师：伟俞萍实验日期： 2015年9月29日目录1.原理3印迹技术31.2 RT-PCR41.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳2D-PAGE52.操作步骤5 安装垂直板型电泳装置5 凝胶的制备5 转膜6 封闭6 一抗反响6 洗涤7 二抗反响7 洗膜7 检测73.实验结果83.1 照片记录8 数据处理84.讨论101.1 Westen印迹技术蛋白质印迹技术又称免疫印迹技术和Western印迹技术(Western blotting)，是鉴别蛋白质的分子杂交技术。Western blot
2、ting的原理是将经过SDS-PAGE别离的蛋白质样品转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。且能保持电泳别离的蛋白质的相对位置不变转膜装置和预染的标准相对分子质量蛋白的转膜结果见图8-2-55-2-7。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反响，再与酶或同位素标记的二抗反响，经过底物显色、化学发光或放射自显影，可以检测电泳别离的某种特定蛋白成分的存在和含量。该技术也广泛应用于检测某种蛋白的表达水平。Western blotting实验过程主要有以下几个步骤：1、SDS-PAGE别离待检测的蛋白质；2、转膜：将SDS-P
3、AGE别离的蛋白质转移到膜上；3、封闭：即利用非反响活性物质封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质的区域；4、抗体结合：即利用相应蛋白质的抗体一抗与待测蛋白质进展免疫结合，再与酶或同位素标记的第二抗体起反响；5、底物显色或放射自显影检测电泳别离的特异性目的蛋白的存在与否和含量。Western blotting的转膜方式以电转移最为常用，固相载体主要有：硝酸纤维素薄膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜PVDF膜。硝酸纤维素薄膜结合蛋白的能力为100ugcm2，综合性能较好，以往使用的人较多；尼龙膜结合蛋白质的能力较强(480ug/cm2)，有很高的灵敏度，但结合背景较高；PVDF-膜具有较好的结合蛋白质的能力2
4、00ug/cm2，且能较结实地结合蛋白质，该膜的机械性能和化学特性强，不易卷曲或撕裂，在90%甲醇的脱色条件下也不会影响膜的结构，结合在膜上的蛋门质可以直接进展序列分析，具有较好的染色和检测的兼容性。常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP等，辣根过氧化物酶最敏感的底物是3，3-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位被反响转变成棕色沉淀。在钴或镍离子存在下进展反响可以加深沉淀的颜色并提高反响的灵敏度。但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反响，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反响。碱性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-引哚磷酸氮蓝四
5、唑(BCIP/NBT)在原位转变为深蓝色化合物。这是利用二抗标记物进展的显色反响是最早的Western blotting检测方法，现在主要用于免疫组化，在显微镜下观察。该方法的灵敏度相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白。ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶(HRP)催化发生化学反响，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现，或使用Luminometer检测。溶液A主要成分为Luminol与特制发光增强剂，溶液B主要成分为H2O2与特殊稳定剂。发光液A和B在HRP的催化作用下Luminol与H2O2反响生成一种过氧化物，过氧化物不
6、稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在激发过程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP没有降解失活，是可以重复加发光液进展观察的。ECL化学发光检测灵敏度高，可以检测pg水平的目标蛋白。Western blotting 示意图1.2 RT-PCRRT-PCR是一种在转录水平上检测基因的方法。首先提取组织或细胞中的总RNA，然后以RNA主要是mRNA为模板，以与RNA 3端互补的引物或Oligo-dT在逆转录酶的作用下进展逆转录，生成cDNA的第一条链。然后以cDNA 3端互补的引物以与与RNA 3端互补的引物组成引物对进展PCR
7、扩增，最后通过电泳来检测是否产生PCR的扩增区带，判别目的基因是否表达。为了防止由于RNA的降解而导致阴性的实验结果，在进展RT-PCR时要设立一个参照管家基因的表达，以防止出现假阴性结果。同时参照可以对基因表达的变化起到半定量的作用。RT-PCR技术灵敏性高，常用于检测细胞中是否表达了某种RNA，是基因表达检测的方法之一。1.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳2D-PAGE利用蛋白质的等电点和分子量的差异，通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质别离开。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的双重优点。第一向电泳是等电聚焦，在细管中进展，蛋白质根据其等电点不同进展别离
8、。而后将凝胶从管中取出，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进展第二向电泳。在第二向电泳过程中，蛋白质依据其分子量大小进展别离。由于双向电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白 。2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术，是蛋白质组研究中最早的支撑技术之一。在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中别离。接着被转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被别离。用适当的染色技术显示被别离的蛋白。2.1 安装垂直板型电泳装置将玻璃板用蒸馏水洗净晾干。把玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。2.2凝
9、胶的制备1. 别离胶的制备：在一个干净的小烧杯中，按下表所列的试剂用量配置。根据室温来调节TEMED的参加量。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶别离胶配制用量表30%stock acrylamide凝胶贮液3mol/L Tris-HCl缓冲液，别离胶缓冲液10% SDSddH2O10% Ammonium persulfate2% TEMED将所配置的凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的面用1000uL取液枪加至长、短玻璃片的窄缝，加胶高度距样品槽模板下缘约1cm。沿玻璃片壁加一层异丙醇用于隔绝空气，使胶面平整。凝胶配置过程要迅速，加速剂TEMED要在注胶前再参加，否如此会提前凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完
10、成，防止产生气泡。2. 浓缩胶的制备：在另一干净的小烧杯中，按表配置浓缩胶，应根据室温来调节TEMED的参加量。混匀后用细长头的滴管或1000uL取液枪将凝胶溶液加到已聚合的别离胶上方，直至加满，轻轻将“梳子插入浓缩胶插入“梳子的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽。约30 min后凝胶聚合，再放置30min。小心拔去“梳子，用窄条滤纸吸去样品凹槽多余的水分。4.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶别离胶配制用量表30%stock acrylamide凝胶贮液3mol/L Tris-HCl缓冲液，别离胶缓冲液10% SDSddH2O10% Ammonium persulfate2% TE
11、MED2.3 转膜戴上手套，取下电泳好的凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，立即放在3转膜缓冲液浸湿的Whatman 3MM滤纸上，将电泳完毕的凝胶放放在滤纸上面。盖上1经甲醛激活的PVDF膜用刀片切除多余的滤纸和滤膜，使其大小均与凝胶完全吻合排除气泡后，盖上另3同样处理的滤纸，排除气泡。按照顺序：负极3层滤纸-凝胶-膜-3层滤纸-正极。用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置，将电泳槽搁置冰上。90V电压1h。取下膜放入培养皿中参加立春红预染1min初步观察转膜结果TBST淋洗保存。(转膜后的PVDF膜晾干后可在4冰箱中保存1周。2.4 封闭电泳完毕后取下PVDF膜，用TBST淋洗后参加封闭液，室温
12、摇床轻摇1-3h，2.5 一抗反响取出PVDF膜，用TBST淋洗，放入含1：10000稀释的一抗溶液中用TBST稀释室温至少1h或者4过夜。2.6 洗涤回收一抗放置4保存必要时参加叠氮钠防霉用lTBST漂洗PVDF膜3次，每次10min2.7 二抗反响PVDF膜放入1：3000倍稀释的HRP标记的第二抗体溶液中用TBST稀释，置温室摇床1h。2.8 洗膜1TBST洗涤3次，每次10min2.9 检测将PVDF膜上加ECL化学发光液A、B准备0.5mL等量混合，可直接加在PVDF膜上，反响5min后在化学发光检测仪上观察并记录实验结果。3.1 照片记录最后加ECL化学发光液这一步是教师操作，为节
13、约时间三组一起进展，其中第一组是我们组的可以观察到我们组25号 26号的二号框中，左侧局部约为右侧局部粗细的1.5倍，与浓度比1.5：1相符合。根据实验结果，可以看到一号框与二号框总体结果较好，条带粗细的比例与加样浓度比例相符，其中三号框别的组的条带几乎没有条带，分析应该有这几种可能性：1、一抗和二抗失效；2、一抗与二抗不匹配；3、ECL液失效；4、抗体染色不充分；5、被测样品中不含有目的蛋白质或者目的蛋白质含量太低；6、溶液中有二抗标记物的抑制剂；7、抗体活力降低；8、转膜时未充分接触。由于实验的材料三号框他们组和我们组所用材料是一样的，所以排除了可能性1、2、3，又由于在实验二本次是实验三
14、中他们组没有出问题，所以排除了可能性5，如此根据具体情况，我想可能性7和8的概率更大，应该是抗体拿出来之后离开冰浴时间太久。可以更换抗体重新再做一次，判断实验结果。或者直接不变条件重新操作，看是否是因为转膜的问题。而四号框的情况，明显有气泡，另外就是条带特别粗，又连在了一起，我想可能是加样量很多或者是发光液加的过多。可是试一试用PBST洗膜20min，期间换2次液。再看是否变正常一点。而为了防止有气泡，玻璃板一定要洗干净，用酒精洗干净之后再用双蒸水冲，再晾干。配胶的时候沿管壁缓缓参加各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。同时配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。特别是枪打到底的时候非常容易产生气泡。加完别离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。别离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。 还有一个可能制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在4存放，室温制胶时由于温差与凝胶聚合反响放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡。防止的方法是将制胶成分中除催化剂外的局部配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再参加催化剂制胶。虽然这次的条带相对不错，但是在日后做Western的时候，还是要特别注意以上几点易错的地方。 /
