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1、ELISA原理一一操作规则（新手适用）点击次数：3347发布时间：2010-7-12 8:45:33ELISA原理一一操作规则（新手适用）酶联免疫吸附实验 ELISAELISA 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传 染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量 测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自 动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份 标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定 体液中的循环抗原，所以
2、也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域 的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究 抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。一实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA） 是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型 的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加 待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）待测 抗体（抗原
3、）酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借 助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色 产生成正比。二实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，BD半乳 糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6磷酸葡萄糖脱氧酶等。 常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化 物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的 氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表
4、示。氯化血红素 辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度 和纯度计算式是(已知HRP的A (1cm 403nm 1%)=25，式中1%指HRP百分浓 度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP 纯度(RZ)=A403nm/A275nm 纯度 RZ( Reinheit Zahl) 值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。 用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。ELISA 的基本原理有三条：(1) 抗原或抗体能以物理
5、性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯 表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；(2) 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能 保持其免疫学和酶学活性；(3) 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定 是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成 正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。三、实验方法基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110ug/ ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml, 4C过夜。次日，弃去孔
6、内溶液，用洗涤缓冲 液洗 3 次，每次3 分钟。(简称洗涤，下同)。2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37C孵育1小时。 然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。 37C孵育0.51小时，洗涤。4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml, 37C1030分钟。5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度 越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅
7、，以+”、“-”号表示。也可测OD 值：在ELISA检测仪上，于450nm （若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零 后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。基本方法二 用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至11 Oug/ml,每孔加0.1ml, 4C过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37C孵育1小时，洗 涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml, 37C孵育30-60分钟，洗涤, 最后一遍用 DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”
8、的 4、 5、 6。（二） 酶与底物酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是 ELISA 成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示 出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。免疫技术常用的酶及其底物酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*四甲替联苯胺黄色460*氨基水杨酸棕色449邻联苯甲胺兰色4252,2 -连胺基-2 （3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）铵盐蓝绿色642碱性磷酸酯酶葡萄糖氧化酶4-硝基酚磷酸盐（PNP）黄色400萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500ABTS+HRP+葡萄糖黄色葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色4
9、05,420甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG）荧光360,450硝基酚半乳糖苷（ONPG）黄色420B-D半乳糖苷酶* 终止剂为2mol/L H2SO4*终止剂为2 mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。可催化下列反应：HRP+H2O2-复合物复合物+AH2-过氧化物酶+H2O+AAH2 为无色底物, 供氢体； A 为有色产物。（三）ELISA常用的四种方法1直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； 加底物。底物的降解量=抗原量。2间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面；加抗体, 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体； 加底物。测定底物的降解量=抗体量。3双抗
10、体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物;加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;加底物。底物的降解量=抗原量。4. 竞争法测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面;（1）加入酶标抗原；（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。三仪器和材料1. 聚苯乙烯微量细胞培养板-酶标板（平板, 40孔, 96孔）。2. 酶联免疫检测仪，50ul或lOOul加样器。3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,工作稀释度1:1000。4. 包被液：0.05mol/L P
11、H9.6碳酸盐缓冲液,4C保存。Na2CO3 0.159克, NaHC03 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。5. 稀释液：同洗涤缓冲液。【或者牛血清白蛋白（BSA）0.1g加入洗涤缓 冲液至100ml；或者加羊/兔血清与洗涤液配成5-10%】6. 洗涤缓冲液：0.01mol/LPH7.4 PBS-Tween-20,于 4C保存。NaCl 8g,KH2PO4 0.2g, Na2HPO4 12H2O 2.9g, Tween-20 （0.05%） 0.5ml。蒸馏水加至 1000ml。7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制，0.1M柠檬酸
12、（2.1g/100ml）6.1ml,0.2M Na2HPO4 12H20（ 7 .163g/100ml）6.4ml,蒸馏水 12.5ml,邻苯二胺 10mg, 溶解后，临用前加30%H2O2 40ul。9. 终止液：2mol/LH2S04。蒸馏水178.3ml逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。四. 操作步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释，一般为I10微克/孔，每孔加 200微升，37C温育1小时后，4C冰箱放置1618小时。2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将 反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。3. 加封闭液200微升，37C放置一小时。4. 洗涤同2。5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200微升。同时作 稀释液对照。37C放置2小时。6. 洗涤同2。7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,每孔200微升，放置37C 1小时。8. 洗涤同2。9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10 15分钟。10. 加终止液：每孔50微升。11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
