《微生物实验技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物实验技术（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、广州市玉岩中学校本课程微生物实验技术 “科技教育特色项目”微生物纯化项目配套教材唐红梅编前 言2010年广州市玉岩中学生物科组申报到了第五批广州市学校“科技教育特色项目”- “微生物纯化研究项目”，配合此项目特编写微生物实验技术一书，以便较为系统地教会参赛学生一些基本的微生物实验操作技术，为其进一步发展奠定一定的基础。本课程的主要内容有清洁玻璃器皿、灭菌方法、培养基的制备、微生物的分离和纯化实验、选择性培养基筛选目的菌株实验、革兰氏染色法、微生物菌种的保藏等。具体如下：内容序号实验项目名称基本实验技能1清洁玻璃器皿2灭菌方法3培养基的制备微生物的分离、筛选与纯化4微生物的分离和纯化实验5选择性
2、培养基筛选目的菌株实验微生物的保藏6微生物菌种的保藏微生物的鉴定方法7革兰氏染色法、附常用培养基配方、染色法及染色液的配制 编者 2011年10月实验一 清洁玻璃器皿（1）一般的玻璃仪器（如烧瓶、烧杯等）：先用自来水冲洗一下，然后用肥皂、洗衣粉用毛刷刷洗，再用自来水清洗，最后用纯化水冲洗3次（应顺壁冲洗并充分震荡，以提高冲洗效果）。计量玻璃仪器（如滴定管、移液管、量瓶等）：也可用肥皂、洗衣粉的洗涤，但不能用毛刷刷洗。（2）精密或难洗的玻璃仪器（滴定管、移液管、量瓶、比色管、玻璃垂熔漏斗等）：先用自来水冲洗后，沥干，再用铬酸清洁液处理一段时间（一般放置过夜），然后用自来水清洗，最后用纯化水冲洗3
3、次。（3）洗刷仪器时，应首先将手用肥皂洗净，免得手上的油污物沾附在仪器壁上，增加洗刷的困难。（4）一个洗净的玻璃仪器应该不挂水珠（洗净的仪器倒置时，水流出后器壁不挂水珠）。实验二 灭菌方法将物体上的所有微生物包括细菌芽孢全部杀死或除去的措施。灭菌的方法有加压灭菌、紫外线照射灭菌、过滤除菌和化学药剂灭菌。应用灭菌技术可对接种室、玻璃器皿、发酵罐、培养皿等进行灭菌，这是进行微生物学研究和微生物工业生产所不可缺少的。一、常用的灭菌方法有：（一）干热灭菌1.焚烧：是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废弃物品或尸体等。2.烧灼：直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌. 3.干烤：用烤箱
4、灭菌。一般加热至160170经2小时。适用于高温下不变质、不蒸发的物品，如玻璃器皿、瓷器等。（二）湿热灭菌 1.煮沸法：1个大气压下，煮沸的水温为100，一般细菌繁殖体煮沸5分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸12小时，才被杀死。水中加入 2%碳酸钠，既可提高沸点达105，促进细菌芽胞的杀灭，又可防止金属器皿生锈。2.巴氏消毒法:用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热61.162.8半小时即可，常用于牛奶和酒类等的消毒。3. 间歇灭菌法:是利用反复多次的流通蒸汽加热，杀死细菌所有繁殖体和芽胞的灭菌法。具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺流通蒸汽灭菌器内，100
5、 加热1530分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽灭菌器内进行的。加热时蒸汽不能外溢，容器内温度随蒸汽压的增加而升高，杀菌力也大为增强。通常在1.05kg/cm2的压力下，温度达121.3,维持1530分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌 （三）滤器除菌凡是具有生物活性的物质，要保持生物活性一般都不能用高压灭菌。生物素及组氨酸溶液也只能用滤器除菌。二、选择消
6、毒、灭菌方法的原则根据物品污染后的危害程度选择消毒、灭菌的方法。（1）高度危险的物品：必须选用灭菌方法处理。（2）中度危险性物品：一般情况下达到消毒即可，可选用中水平或高水平消毒法。但中度危险性物品的消毒要求并不相同，有些要求严格。（3）低度危险性物品：一般可用低水平消毒方法，或只做一般的清洁处理即可，仅在特殊情况下，才作特殊的消毒要求。例如，当有病原微生物污染时，必须针对污染病原微生物的种类选用有效的消毒方法。3.根据物品上污染微生物的种类、数量和危害性选择消毒、灭菌方法。（1）对受到细菌芽胞、真菌孢子、分枝杆菌和经血传播病原体（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等）污染的物品，选用高水
7、平消毒法或灭菌法。（2）对受到真菌、亲水病毒、螺旋体、支原体、衣原体和病原微生物污染的物品，选用中水平以上的消毒法。（3）对受到一般细菌和亲脂病毒等污染的物品，可选用中水平或低水平消毒法。（4）对存在较多有机物的物品消毒时，应加大消毒药剂的使用剂量和（或）延长消毒作用时间。（5）消毒物品上微生物污染特别严重时，应加大消毒剂的使用剂量和（或）延长消毒作用时间。4.根据消毒物品的性质选择消毒方法 选择消毒方法时需考虑，一是要保护消毒物品不受损坏，二是使消毒方法易于发挥作用。（1）耐高温、耐湿度的物品和器材：应首选压力蒸气灭菌；耐高温的玻璃器材、油剂类和干粉类等可选用干热灭菌。（2）不耐热、不耐湿，
8、以及贵重物品：可选择环氧乙烷或低温蒸气甲醛气体消毒、灭菌。（3）器械的浸泡灭菌：应选择对金属基本无腐蚀性的消毒剂。（4）选择表面消毒方法：应考虑表面性质，光滑表面可选择紫外线消毒器近距离照射，或液体消毒剂擦拭；多孔材料表面可采用喷雾消毒法。微生物对消毒因子的敏感性一般认为，微生物对消毒因子的敏感性从高到低的顺序为：1.亲脂病毒（有脂质膜的病毒）如乙型肝炎病毒、流感病毒等。2.细菌繁殖体。3.真菌。4.亲水病毒（没有脂质包膜的病毒）如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。5.分枝杆菌：例如结核分枝杆菌、龟分枝杆菌等。6.细菌芽胞：例如炭疽杆菌芽胞、枯草杆菌芽胞等。7.朊毒（感染性蛋白质）。实验三 培养
9、基的制备一、 目的学会和掌握培养基的配制方法二、实验原理：培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基要选择合适的配比关系；选择合适的理化性质；配后要及时灭菌。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生
10、物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法等。三、实验内容：1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备（1）计算根据配方计算出实验中各种药品所需要的量，然后再分别称量。（2）称量准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量，然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。（3）溶解向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。（4）调pH值用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。（5）分装根据不同
11、需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。（6）包扎试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。（7）灭菌培养基用0.1Mpa高压蒸汽灭菌1520min。2.培养基的高压蒸汽灭菌灭菌原理：水的沸点可随压力的增加而提高，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，因锅是密闭的，蒸汽不能溢出，而使压力增加，水的沸点和温度也随之增加。因此，高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温，以及热蒸汽的穿透能力来达
12、到灭菌的目的。一般在0.1Mpa的压力时，温度可达121只要维持1520min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。灭菌方法：（1）加水于灭菌器内到规定的水平面。（2）需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基），棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。（3）将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。（4）打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5l0min，关闭放气阀。（5）关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力
13、和温度都上升，直至压力表指针达到所需压力时，开始计时，通过调节热源，维持此压力到所需时间。（6）灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。 （7）打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。（8）灭菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。3. 注意事项(1)要严格按配方配制。(2)调pH不要过头。(3)高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 实验四 微生物的分离和纯化一、目的 学习和掌握微生物的分离和纯化的基础操作技术二、原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝
14、大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多
15、有用的菌株。三、器材高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。四、操作步骤1稀释涂布平板法(1)倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至5560时，向高氏1号琼脂培养基中加入10酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30g。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管(瓶)口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约1
