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1、浅述蛋白质分离纯化的新技术摘 要： 本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、 双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应 用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。文章最后展望了蛋白质 分离纯化技术的发展趋势。关 键 词： 分离纯化 蛋白质 进展 生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制 造、生产人们急需的多种蛋白质。 和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般 也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含 有目标产物的物料进
2、行处理、分离、纯化、加工目标产物。本文主要综和近年来国内外的研 究结果，介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。2. 蛋白质的分离纯化方法：2.1浊点萃取法(CPE)：2.1.1 概念及原理：浊点萃取法(cloud point extraction, CPE)1是近年来出现的一种新兴的液一液萃取技术， 它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现 象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。目前该法已成功地 应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中2-5。CPE 法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质一一浊点现
3、象。溶液静 置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的 5)；另 一为水相(胶束浓度等于CMC)。外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为 均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进 表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质 分离的萃取方法就是浊点萃取。图 1 显示了由温度变化引发的这种相分离现象。温度的改变， 引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。2.1.2 蛋白质分离纯化中的应用：CPE 法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些分离方法如硫
4、 酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱方法联用。另外， CPE 法分离纯化蛋白质已经 可以实现大规模操作。 Minuth 等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。虽然 使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行，但商品离心分离器用于CPE的效率和容量仍 需进一步研究。而且，他们发现相分离操作受细胞培养时产生的表面活性物质影响较大，体 系两相间密度差较小，表面张力较小，含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂，操作较 难。表1列出了 CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。(1) CPE法用于分离纯化膜蛋白 膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)硫水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既要削弱它
5、与 膜脂的硫水性结合，又耍使它保持硫水基在外的天然状态，较难分离纯化。由于表面活性刑 具有两亲性，它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。增溶时，膜蛋白琉水部分嵌入胶束的硫水核 中而与膜脱离，又保持了膜蛋白表面的废水结构。相分离后，膜蛋白与表面活性剂共同析出， 与亲水性蛋白质分离。所以， CPE 法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。(2) 与其它分析技术的联用CPE可以作为高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪器分析的样 品前处理方法，提高检出灵敏度。表面活性别可以防止样品吸附在玻璃容器上，易于与FIA 中的载液及 HPLC 中的有机流动相或胶束流动相混合，可以直接进样。但
6、是在很多应用中 需要除去表面活性剂后再与仪器联用。将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。对于CMClmM的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法，但操作时间较长(24h左右)。对 于 CMC 较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去，如凝胶柱、毛纫管柱等，分离出的表面 活性剂可以再利用，也可以作焚烧处理。但CPE作为HPLC的样品前处理方法有两个缺点： 第一，常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收。第二，操作时间较长，从色谱柱上 需用几个小时洗脱表面活性剂。表面活性剂的洗脱可能会干扰分析物的测定3。2.2 置换色谱法：2.2.1 概念及分离机理：置换色谱(displacement chroma
7、tography)6作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱 柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相表 面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序， 形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱7。置换色谱的分离行为与 样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。置换色谱要求样品组分及置换 剂的吸附等湿线应为 Langmuir 型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能 力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方7，见图1(A)。根据物料平衡方程， 置换剂在柱中的移动速度u
8、D有下列关系：式中uD为流动相的线速，巾为相比，qD和cD分别为置换剂在固定相和流动相中的浓度， qD / cD是直线OD的斜率，称之为操作线(operating line)。当操作线的斜率小于被分离组分 等温线的起始斜率，样品才能进行置换展开，最终形成如图l(中的置换序列，这是在理想的 情况下(假定无轴向扩散及二次化学平衡 )获得的置换色谱图。每一组分形成矩形的平台 (Plateau)洗脱峰，相邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台阶 状的色谱图。此时，样品中不同的组分以置换剂的速度前进，即达到等速状态 (isobathic conditions)：uD=u2； u3 = u4式中 u2、u3、u
9、4 指被置换的三组分的速度2.2.2 影响置换色谱分离的因素：(1) 置换剂 置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离和纯化目标产物的关键因素之一7,8。对于蛋白 质生物大分子的置换色谱来说，多离子型的置换剂与离子交换续料相结合是目前常用的分离 方式。传统观点认为分子量相对大的聚电解质是较合适的置换剂，因为它们对固定相的结合 比分离物更强，如羧甲基葡聚糖(CMD)、硫酸葡聚糖、羧甲基淀粉(CMS)9、硫酸鱼精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖(PPS)等。近期的 研究表明，低分子量的化合物作为置换剂则更有优势，因为即使置换剂与蛋白质产物的峰有 叠加，在后处理过程中，低分子量置换剂则较容易从目标产物中分离；同时
10、，合成低分子量 置换剂成本较低，色谱柱再生过程也比分子量大的置换剂快。(2) 固定相 理想的固定相应具备以下条件：样品及置换剂在固定相上应有较强的吸附作用，且吸附是可 逆的；样品及置换剂在固定相上的吸附等温线应为Langmuir型；样品各组分在固定相上的 吸附能力应有较大差别，以保证置换色谱带的交叠部分尽可能小而获得良好的产率；有较好 的化学稳定性，可适用于不同 pH 值的缓冲液和有机溶剂；有较大的比表面及吸附容量；有 较好的机械强度，而且容易再生。置换色谱中的环境不同，置换效果也不一样，即使是选用 同样的硅胶，由于来源和制备方法上的差异也会影响置换效率。反相 色谱中使用的烷基硅胶柱常被应用于
11、置换色谱。同其它硅胶固定相相比，烷基硅胶柱由于柱 容量低及非选择性吸附等缺点，很少被用于洗脱色谱，但它却可以用于置换色诺，并成功地 分离了对映异构体。1、问题：电渗纯化蛋白质，结果几乎没得到蛋白，请问哪位有高见今夜纯化蛋白，本以为 唾手可得，结果却大失所望我用SDS-PAGE分离，KCL显带，割胶，而后电渗分离，测 OD 值极低，请问哪位有这方面的经验或其它方法，望赐教。解决：多挖点胶，收集起来， 放在1.5离心管里，用PBS捣烂，4度 过夜。然后离心，收集上清即可。最后，把上清冻 成干粉。2、问题：蛋白质提纯的方法：SDS-PAGE and N-terminal amino acid seq
12、uence analysis, (dahuaidang) SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in 12% acrylamide and 0.1% SDS with adiscontinuous Tris-glycine buffer system. Purified enzyme was subjected to SDS-PAGE and electroblotted tolmmobilo-PSQ 0.45“m polyvinylidene fluor edebrane (Millipore). Af
13、ter the membrane was stained withPonceau S (Sigma), the enzyme protein was cut out and washed with methanol. The membrane strip holding the protein was subjected to automatic Edman degradation for sequencing of the N-terminal aminol acids using anApplied Biosystems 477A protein sequencer (Parkin Elm
14、er).3、问题：蛋白质纯化，装柱，过柱应注意事项有哪些？(dahuaidang) 现在要进行蛋白质纯化，有关装柱和过柱的注意事项有哪些呀？还有，需要测序的蛋白质样 品，大概需要多少，样品要求有哪些。柱子sephadex-200,和DEAE-纤维互素。第一，手工装柱一般只适宜于大量蛋白质的提取。分子筛柱一般在盐析以后用效率才高，因 为它的分媛实汀R话阄叶荚蕹捎茫龋校蹋弥 颍疲校蹋弥?Gelfitration column).如果手工装 柱，长度应是内径的6 0 8 0倍，一般柱长应在1.2-2米，对于软胶，走一次柱须12小 时以上，对硬胶，也需5 6小时。第二，仪器检测器灵敏度调整：最重要的是
15、确定仪器工作正常，信号相应正常。可用在检测 器出口通气泡和检测器入口注射有色样品的方法确认仪器正常和估计灵敏度。第三，均匀, 无气泡，平衡充分，分子筛要注意长度与直径比。测序的蛋白量 我用的方法 的量是 SDS-PAGE第四，如果是测序的话，跑SDS-PAGE把染出的蛋白质带,挖下来，直接拿去做质谱，只要你有 钱国家生物医学分析中心。还有就是要保证挖的是一个蛋白质带 ,不能含杂蛋白质的,不然, 把杂蛋白质测了怎么办。第五，测序跟质谱不是一回事儿的。做质谱可以做分子量和质谱图，但是未必是序列。序列 是要单测的。北大有位老师可以做： 180块钱一个氨基酸。做质谱多得是：测分子量大约是 450块钱了
16、，测图谱的要一千多块。4、问题：跑 SDS-PAGE 有好多带，而过柱时却没有峰，原因是什么？1、会不会是洗脱太快。2、查查有没有断层。3、SDS-PAGE 分离能力强， 而在柱子 FRACTION 中几个低峰依次串在一起就不明显了。4、上柱前样品要浓缩，保证样浓度不能太低。如没浓缩，检测仪的量程又没选好，可能看 不出来。5、Sephadex 是 Amersham 公司经典的层析填料，有很高的选择性，不同颗粒大小的填料有 不同的分离范围，主要用于凝胶层析(亦称分子筛)。粗颗粒流速较快，细颗粒流速较慢， 但分辨率较高。Sephadex 200的分离范围(以球蛋白计)是5 60kDa。这种填料的另一个 优点是较便宜。(也够贵的)现已被新一代Bioprocess填料代替。DEAE-纤维素 我没用过，应该是用于离子交换吧。这是一种弱阴离子填料。 以下情况都是正
