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1、中草药鉴定种特异性 DNA 探针的筛选方法（作者:单位: 邮编: ）【摘要】 基因芯片技术为中草药高效、并行、快速鉴 定提供了可能。而中草药种特异性探针的筛选是中草药基因芯片鉴定 技术开发的关健。文章结合当今中药鉴别芯片和其它物种鉴定芯片研 究进展总结了几种适合中草药特异性探针筛选的方法。【关键词】 基因芯片； 中草药鉴别； 种特异； DNA 探针Abstract:DNA chip technology makes it feasible to identify Chinese herbal medicine rapidly, efficiently and in parallel. The
2、screening of species-specific DNA probes from medicinal plants is the key step in developing DNA chip for the authentication of Chinese herbal medicines. Combined with current DNA chip researches on identification of herbal plants or other species, some methods available for the screening of medicin
3、al plants species-specific DNA probes were summarized in this paper.Key words：DNA chip; Herbal medicine; Species-specific DNAProbe在中药材基因鉴别和特征性基因测序的基础上，建立以基因诊断和 基因芯片为载体的中药材分子鉴别技术和方法是今后中药生物技术 研究中的努力方向之一1。中药鉴定的基因芯片技术是指采用原位 合成或显微打印手段，将中药种特异性DNA探针固定在玻璃片、尼龙 膜或其它支持物表面上，形成二维DNA探针阵列，然后与荧光或DIG 标记待检中药基因组DNA样本杂
4、交，通过检测杂交信号来实现对中药 的准确、并行、髙效地检测。虽然DNA芯片技术已广泛应用于DNA测 序2、单核苷酸多态性分析3、基因表达分析4、基因诊断5、 药物筛选6、微生物种类鉴定等7各个方面，但应用于中药鉴 定尚处于起步阶段，近年来随着基因芯片技术的广泛应用，国内外一 些研究机构已开始研究使用基因芯片对中药（材）进行鉴别8 ， 9。采用基因芯片技术鉴定中药的基本过程是10：应用分子生物学 技术找出待鉴定中药的特定寡核苷酸序列；以此寡核苷酸序列作为 探针，装配到芯片上；检测样品（DNA）的提取、扩增和标记； 杂交检测及结果分析。其中找出待定中药的特定DNA序列（DNA探针） 是建立中草药鉴
5、定基因芯片的关键。本文结合近年来中药及其它物种 鉴别芯片研究进展总结了几种可用于中草药特异性 DNA 片段筛选的 方法，并对这些方法的优势和不足做出评价。1 利用现有药用植物基因资源筛选其特异性片段首先，登录 GeneBank 网站，在核酸数据库中检索研究对象及其相关 种属的基因序列（如植物的rRNA的ITS序列或微卫星序列或某种功能 基因），应用分析软件（如 MacVector 6.5.1 软件包中的 Clustal W ALingnment 程序），对这些序列进行对齐和分析，得到碱基对齐图和 聚类分析的结果。然后根据对齐图找出具有高度多态性的区段，在这 一区段用 Primers 程序设计引
6、物并在相应区段结合 Oligo 5.0 程序找 出所有可能的探针，经过筛选后在 Genebank 中进行 Blast 查询，筛 选出特异性最好的片段作为探针使用。这种方法简单、快捷，充分利用了现有的基因资源。目前很多微生 物检测探针11,12及植物cDNA探针13都是根据已公开的基因 序列设计的。然而，对于大多数药用植物种类，其遗传背景很不清楚。 已注册的药用植物 DNA 序列的数量相对于总的药用植物资源非常有 限，而且这些已知序列中大多集中在少数植物种类14，所以，这 种方法只适合于遗传背景比较清楚或已有相关序列发布的药用植物。2 通过构建的 DNA 文库筛选这种方法要求先构建DNA克隆文库
7、或cDNA文库，然后从文库中随机 选出若干克隆，将各克隆插入片段斑点印迹在杂交膜上（如硝酸纤维 膜、尼龙膜），用标记的本种基因组和其他种基因组的总DNA为探针 分别进行斑点杂交，选择与本种基因组杂交时杂交信号强，而与其他 基因组杂交时无杂交信号的克隆，该克隆的插入序列即为本种基因组 的特异序列。Q. Cai. M.R. Bullen 15从梯牧草属 （Phleum） 两个野生种 P. alpinum和P. bertolonii的DNA文库中分别筛选到它们的特异性探 针。首先，提取 P. alpinum 和 P. bertolonii 的总 DNA,用 Sau3AI 部分酶切，然后将消化后片段用
8、 pUC19 作为载体克隆到 E. coli DH5amcr.构建了 P. alpinum 和 P. bertolonii 的部分基因组 DNA 文 库（P. alpinum 含 3030 个 colonies, P. bertolonii 含 3240 个 colonies）,接着从P. alpinum DNA文库中选了 1230个克隆，从P. bertolonii DNA文库中选了 1320个克隆斑点印迹在膜上，最后和通 过缺口平移法采用a32P -dCTP标记的P. alpinum和P. bertolonii总基因组探针杂交，根据杂交信号挑选到P. alpinum特 异性克隆 8 个，
9、P. bertolonii 特异性克隆 13 个，对其进行测序后 筛选到3个P. alpinum特异性探针和3个P. bertolonii特异性探 针。还有其它通过类似方法筛选到植物种特异性探针的例子16,17。这种方法可以一次筛选大量克隆，能得到相当数量的探针，主要问 题是构建DNA库过程比较繁琐，耗时费力，文库质量也会影响筛选效 果。再是如果从cDNA文库中筛选，因cDNA是切除了内含子的DNA序 列，而很多内含子本身在种间具有髙度多态性（如rDNA中1ST序列）, 这些序列的切除会降低种特异性探针的筛选效率。3 从 nrDNA 筛选因结构和功能上的差异，植物基因组不同部位的序列变异速度很
10、不 一致，一般情况编码区比较保守，而非编码区序列因其功能上的限制 较少, 比编码区表现出更快的进化速率，不同种间各编码序列或非编 码序列的变异方式和速率也是千差万别。植物细胞核中编码rRNA的 基因分编码区和非编码区，其中编码区的18S与5.8S，5.8S与26S 基因间被两个非编码区 ITS1 和 ITS2 所间隔（如图1 所示）。它们共 同组成一转录单位一一顺反子（cistron），顺反子髙度重复（几百至 几千次 ） , 以串联的方式排列于核染色体上 , 并且这些核糖体 RNA 顺反子拷贝表现出髙度的均一性（homogeneity） 18。据此特征， 可根据保守区序列设计引物，扩增出易变异
11、区DNA片段，通过对扩增 产物测序分析后，从中筛选出可做为种特异性探针的寡核苷酸序列 19。3.1 ITS （内转录间隔区）髙等植物中nrDNA序列差异主要表现在ITS、ETS及IGS等非编 码区上。被子植物中 ITS 序列既具有核苷酸序列的髙度变异性又有 长度上的保守性。有研究表明18：被子植物大多数科属其ITS序 列的种间差异值为1.2%10.2%，属间差异值为9.6%28.8%，这 对系统发育研究来说都是较合适的范围，也适合从这些序列中筛选种 特异性探针。 Zhang Y B 等 20 将 16 个不同 种 属 石斛的 ITS1-5.8S-ITS2 序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用荧
12、光标记 的 ITS2 序列作为探针,可检测出 5种已被载入中国药典的石斛 该基因芯片还可检测出含有 9 种不同的中药材复方中的石斛。刘建 全等21 从市售“藏茵陈”药材中提取DNA , PCR扩增ITS1-5.8S rDNA-ITS2 整个片段， 扩增产物直接测序得到约 700 bp 片段，采 用排序和系统发育分析软件分析“藏茵陈”原植物的亲缘关系， 据 此设计的特异性分子快速鉴定试剂盒可对市场上的藏茵陈进行检测。3.2 26S rDNA nrDNA 编码区比较保守，但其中有些可变区，不 同的植物类群，其可变区变异率有很大差别。对于变异率大的类群， 可以据此从中筛选到鉴别dna探针。为了对不同
13、种的贝母进行区分，香港城市大学及香港理工大学的研 究者22设计了一种基因芯片可有效地对不同种的贝母进行区分。 他们首先提取9种贝母球茎的基因组dna，用引物对（上游引物5， -GAG TCG GGT TGT TTG GGA-3 ；下游引物 5，- GCT ATC CTG AGG GAA ACTTC-3，）对其26S rDNA基因D2与D3区进行扩增和测序， 从其多态性区段设计了各种属特异性寡核苷酸探针，然后将不同种属 寡核苷探针点置于经多聚赖氨酸处理包被的芯片。用来自不同种贝母 的荧光素标记的 PCR 产物与 DNA 芯片进行杂交，可在芯片特定位置 检测到不同种贝母的荧光信号从而达到区分不同贝
14、母的目的。陈月琴等23从采自陕西秦岭和广东自然保护区的杜仲中提 取总DNA , PCR扩增产物与质粒载体PTZ19连接，Sanger终止法测 定26S rDNA片段，采用计算机分析软件Pcgene 610比较了金缕梅、 栓皮栎、水青树、领春木及前人测定的 8 种植物的同源序列， 找出 其特征性核苷酸序列，为进一步开展杜仲的专一性核酸分子探针研究 奠定基础。3.3 5.8S rDNA Carles Maria 等24设计和制作了一种能鉴 别有毒中草药的 DNA 芯片。 芯片中种特异性寡核苷酸探针来源于 Aconitum carmichaeli， A. kusnezoffi， Alocasia m
15、acrorrhiza， Croton tiglium，等 17 种中药的 5.8S rRNA 基因及 Aconitum pendulum 和 Stellerachamaejasme 的 Leu-tRNA 基因，这些探针通 过巯基连接固定在硅片上，靶基因序列通过不对称PCR扩增和荧光标 记后与芯片 杂交，通 过 这种并行的基 因 分型技术( parallel geno typing )可以将多种有毒草药种类鉴别出来。3.4 18S rDNA G.fragilis 是一种产生大量粘液状物质的微藻， 在亚德里亚海的大量繁殖时严重影响水产和旅游业。为了对其进行监 测，F. TintiL 等25从 G.
16、 fragilis 的 18S rDNA 中筛选出了 可用作检测海水中 G.fragilis 的寡核苷酸探针。主要过程是：从培 养的G. fragilis细胞提取其总DNA,用引物对16S1N-16S2N扩增其 18S rDNA 基因，对扩增产物纯化后进行测序，测序结果与 GeneBank 中 Lingulodiniumpolyedrum,Gonyaulaxspinifera,Protoceratium reticulatum (亚德里亚海中浮生植物群落中常和G. fragilis生长 在一起)的同源序列进行比对，比对后发现 G.fragilis 的 18SrDNA 核苷酸序列 与其它种有明显的不同，因 此可用此序 列用 于 G. fragilis 鉴定的特异性探针或制成芯片用于海水中这种有害藻种的 常规监测。从上述例子可以看到有些探针的是从rRNA编码区
