《肺癌外周血中EGFRmRNASPDmRNALUNXmRNA表达的临床意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肺癌外周血中EGFRmRNASPDmRNALUNXmRNA表达的临床意义（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、肺癌外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表达的临床意义 作者：仲崇俊，蒋庚西，陶国华，王永旺【摘要】 目的：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测肺癌患者肿瘤组织和外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表达，探讨其作为肺癌微转移检测分子标志物的可行性。方法：应用RT-PCR技术检测40例非小细胞肺癌组织和15例肺良性病变组织中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表达；检测40例肺癌患者外周血中靶基因的表达，并以15例良性肺疾病患者和10名健康人外周血作为对照。结果：40例肺癌患者病理组织中EGFR mR
2、NA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表达率为77.5%（31/40）、100%（40/40）、100%（40/40），外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表达阳性率分别为55.0%（22/40）、52.5%（21/40）和57.5%（23/40）；对照组中15例肺良性病变患者病理组织中EGFR mRNA表达率为13.3%（2/15），无SP-D mRNA和LUNX mRNA表达，15例肺良性病变患者和10名健康人的外周血中无EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表达。结论：EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA作为
3、检测肺癌组织及肺癌外周血微转移的分子标志物具有良好的敏感度和特异性；三者表达与肺癌TNM分期、组织学类型和癌细胞分化程度关系密切。 【关键词】 肺肿瘤；微转移；表皮生长因子受体；肺表面活性蛋白D；肺特异性蛋白X肺癌细胞在术前、术中脱离原发灶，以非常少的数量转移到淋巴结、血液、骨髓或远处器官中，常规临床检查难以发现，此为肿瘤的微转移。RT-PCR技术的发展，使检测外周血中微量癌细胞成为可能。但目前在肺癌微转移的检测中，缺少公认的特异的分子标记物1。本实验采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测了40例非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血中EGFR、SP-D和LUNX的表达，分析其与病理生理
4、学特征的关系，以探讨靶基因作为诊断肺癌微转移的价值。1 材料和方法1.1 一般资料 病例 40例NSCLC患者均来源于本院胸心外科手术患者，病理学诊断明确，且临床影像学检查未见远处转移，其中，55岁31例，55岁9例，男30例，女10例，腺癌22例，鳞癌18例；另选15例肺部良性疾病患者（包括良性肿瘤、肺大泡、支气管扩张等）及10名健康人作为对照组。1.2 试剂与引物设计 参照GenBank，采用Primer Premier5引物设计软件设计EGFR、SP-D和LUNX基因内外引物，EGFR上游:5-CATCTCCGAAAGCCAACA-3，EGFR下游:5-CGACGGTCCTCCAAGTA
5、G-3，扩增产物长度244bp；SPD上游:5-AAAGTGTCGGGGAGAAGA-3，SPD下游:5-TCAGTCATGCTCAGGAAA-3，扩增产物长度178bp；LUNX上游:5-GGGCATTCTGGAAAACCT-3，LUNX下游:5-GGCGTATTCACTTGGAGC-3，扩增产物长度237bp；内参引物为GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）以检测RNA的完整性，GAPDH上游:5-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3，GAPDH下游:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3，扩增产物长度306bp，由上海生工合成。1.3 标本的收集与总RNA抽提 对
6、所有肺癌患者于治疗前抽取新鲜肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离，Trizol试剂一步法抽提总RNA，另对手术切除肿瘤于手术室内切取小块新鲜肿瘤组织液氮速冻保存，取约50100mg行总RNA的抽提。1.4 RNA鉴定 对所抽提的总RNA行紫外分光光度定量，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察。cDNA第一链合成取样品总RNA约2g加入20l反应体系中，按照试剂盒提供的条件进行逆转录。PCR扩增EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA与GAPDH(内参)。按照文献报道方法46，结合实验优化条件进行。具体反应条件分列如下：EGFR、SP-D、LUNX PCR反应体系25l，
7、其中cDNA 2l,10PCR buffer 2.5l,TaqDNA 5U/l 聚合酶0.2l,2mmol/L dNTPmix 2.5l,20mmol/L MgCl2 1.5l, EGFR上、下游引物(10pm/L)各1l,加入适量的双蒸水，使总体积达25l。反应条件:95C预变性5min, 95C变性45s， 50C 45s， 72C 45s，共45个循环，在第15个循环末时加入GAPDH上、下游引物(10pmol/L)各1l，最后72C延伸7min。PCR产物分析 1.5%琼脂糖凝胶电泳，在四星凝胶成像系统下拍照和分析。1.5 统计学方法 使用STATA 7.0统计软件对资料进行分析，相关
8、数据采用2检验和Fisher确切概率法进行处理，P<0.05、P<0.01为差异有统计学意义。2 结果2.1 总RNA鉴定 实验中抽提的总RNA OD260/280值在1.761.97之间，外周血抽提总RNA约50100g，电泳后EB染色可见28s,18s亮带。2.2 EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA检测结果 NSCLC组织和肺良性病变组织检测结果见表1。肺癌组织中，EGFR mRNA与SP-D mRNA、LUNX mRNA的表达差异具有统计学意义（P=0.002）。外周血肺癌与对照组EGFR mRNA、SP-D mRNA与LUNX mRNA检测结果见表2
9、。由表2可见EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3项指标在肺癌组中的表达阳性率有差异，但不具有统计学意义(P=0.904)。在同一分期中，EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3项指标的表达阳性率有差异，但不具有统计学意义（期：P=0.632；期：P=0.924；期：P=0.120）。在同一病理分型中，EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3项指标的表达差异不具有统计学意义（腺癌组：P=0.555；鳞癌组：P=0.207）。在癌细胞分化程度同一组中，EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3项指标的表达差异
10、不具有统计学意义（高：P=0.924；低：P=0.920）。3 讨论采用RT-PCR技术检测组织中肿瘤特异性的mRNA，可以在11061107个正常细胞中检出1个癌细胞，使检测外周血中少量癌转移细胞成为可能。但目前仍缺少公认的特异的分子标记，选择恰当的靶基因是决定检测结果可靠性的关键因素。本组选择EGFR、SP-D和LUNX作为分子标记，通过检测肺癌患者外周血中三者的表达情况，分析其与肺癌患者病理生理特征之间的关系，以期建立起肺癌微转移较可靠的检测方法，为临床诊断治疗和预后判断提供依据。EGFR基因定位于7p1117,表达产物是由1186个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白，与EGF等配体结合后能激活
11、受体酪氨酸激酶，自身及胞浆中多种蛋白质底物磷酸化，转导持续分裂信号到细胞内膜，引起细胞恶性增殖。多项研究表明，EGFR在多数肺癌标本中有过度表达,且与肺癌的转移和预后相关,因此，EGFR mRNA可能是检测血液循环中肺癌细胞合适的指标2。SP-D基因定位于10q2124, SP-D由型肺泡上皮细胞合成分泌，该细胞被认为是肺腺癌的起源细胞。Christoph Betz等应用RT-PCR检测SP-D mRNA,能在106个正常细胞中检出1个癌细胞，并在73.9%(17/23)的转移肺腺癌患者淋巴结中检出SP-D mRNA阳性,而8例对照全部阴性,显示了较高的灵敏度和特异性3。LUNX基因定位于20
12、p11.1q12,全长1015bp,是Iwao等通过mRNA差异显示技术分离的一个人类肺组织特异性基因,它包括一个开放的读码框,编码含257个氨基酸,分子量为26.7kDa的蛋白质。Iwao等用RT-PCR法检测了NSCLC患者手术切除淋巴结中的LUNX mRNA表达，显示该方法具有较高的敏感性和特异性4。本组选择EGFR、SP-D、LUNX基因作为检测分子标志，用RT-PCR检测了肺癌组织和外周血。在40例肺癌组织中，EGFR mRNA表达31例，阳性率77.5%，SP-D mRNA、LUNX mRNA表达各40例，阳性率100%；在15例良性肺肿瘤组织与良性病变肺组织中，EGFR mRNA
13、表达2例，阳性率13.3%，SP-D mRNA、LUNX mRNA表达均为阴性。EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA在肺癌组织和肺良性病变组织中的表达差异具有统计学意义（P<0.001）。说明三者具备作为检测肺癌组织的分子标志物的基本条件，且具有良好的敏感度和特异性。EGFR mRNA在肺癌组织中的阳性表达率低于SP-D mRNA、LUNX mRNA，并且在肺良性病变组织中也出现阳性表达。表明EGFR mRNA作为检测肺癌组织的分子标志物的特异性可能差于SP-D mRNA、LUNX mRNA。与良性肺疾病患者和健康对照组相比，外周血中EGFR mRNA、SP-D m
14、RNA、LUNX mRNA的阳性表达率差异具有统计学意义。表明3项指标具备作为检测肺癌外周血微转移的分子标志物的基本条件，且具有良好的敏感度和特异性。在肺癌组中，3者表达差异无统计学意义，提示3项指标作为检测肺癌外周血微转移的分子标志尚不具有优劣之分。3项指标在肺癌不同分期中的表达差异具有统计学意义。表明肺癌患者外周血微转移与肺癌的TNM分期关系密切，分期越晚，外周血微转移的检测阳性率越高。在同一分期中，三者表达差异无统计学意义。在不同病理分型腺癌和鳞癌中，EGFR mRNA、LUNX mRNA在外周血中的表达差异不具有统计学意义，SP-D mRNA在外周血中的表达差异具有统计学意义。表明在肺
15、癌患者的外周血检测中，SP-D mRNA的表达与肺癌病理分型关系密切，其在肺腺癌组的检测阳性率高于肺鳞癌组；而EGFR mRNA、LUNX mRNA的表达与肺癌病理分型无密切关系。在同一病理分型中，三者表达差异不具有统计学意义。40例肺癌患者外周血中，低分化癌21例， EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 的表达率分别为76.2%、71.4%、76.2%；高分化癌19例， EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 的表达率分别为31.6%、 31.6%、 42.9%，差异具有统计学意义（P=0.005、P=0.012、P=0.028）。表明肺癌患者外周血
16、微转移与癌细胞分化程度具有密切关系，分化程度低，外周血微转移的检测阳性率高。在癌细胞分化程度相同组中，三者表达差异不具有统计学意义（高：P=0.687；低：P=0.920）。癌细胞进入血液和淋巴循环仅是肿瘤转移多阶段、多步骤中的一步，转移最终是否形成，受到癌细胞自身生物学特性、机体免疫状况、局部微循环等各方面影响。但外周血中检测到癌细胞表明了癌细胞较强的转移潜能，预示着预后欠佳。因此，综合考虑肺癌患者外周血EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表达情况与影像学表现，有助于更准确地判定肺癌病人的分期，制定合理的治疗方案，应能提高疗效和改善预后。我们正对本组患者进行随访，以进一步明确肺癌外周血
