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1、大肠菌群的测定一、实验目的：（1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义（2）学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量二、实验原理：大肠菌群系指一群能在37C经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（themostprobablenumber-简称MPN）表示。最近似数（mostprobablenumber-简称MPN）法是一种将
2、样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。三、材料1、样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。2、菌种大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）产气肠杆菌（Enterobacteriaaerogenes）3、培养基及试剂单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基
3、质试剂、麦康凯（MA）4、其它设备和材料温箱（36土1）C、水浴锅（44土。C、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。四、实验步骤（一）检验程序大肠菌群检验程序见图产ffiS扭告甜土I匸（mhi&ir,i5k親*r枇盘班丄氏的歧无譬住杆曲玄蘭帶酔删性大舉善律觥不产（二）操作步骤1采样及稀释（具体材料） 以无菌操作鲜橙多饮料（具体根据实验室提供的确定）25g（或25mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000r/mjn1
4、0000r/min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支Iml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。 根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。2乳糖初发酵试验即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在ImL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管ImL及ImL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置（36土1）C培养箱内，培养
5、（24土2）h,的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者,则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。3分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板，置（36土1）C温箱内，培养18h24h,:然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。4乳糖复发酵试验即通常所说的证实试验:其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌:确能发酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上:挑取可疑大肠菌群12个进行革兰氏染色:同时接种乳糖发酵管，置（36士I）C的温箱内培养（24土2）h：观察产气情况。凡乳糖发酵管产气革兰氏染色为阴性反应的无芽胞
6、杆菌:即报告为大肠杆菌阳性；凡糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性:则报告为大肠杆菌为阴性。5报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表（见表5-4）：报告每100mL（8）食品中大肠菌群的最可能数。试验结果表接种量管发酵反应结果有无典型菌落革兰氏染色结果复发酵反应结果最后结论+或-号123123123注：填写初发酵与复发酵结果应以下列符号表示。“-”表示不产酸也不产气，培养基为紫色；“+”表示只产酸而不产气，培养基变黄色；“”表示产酸又产气，培养基变黄，并有气泡。结果报告根据证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表（见附录）报告每100ml（克）大肠菌群的最可能数.6.附件1g检样中最近似值
7、（MPN）表使用三管法，接种量分别为，和。大肠菌群MPN检索表阳性管数MPN95%可信限1ml(g)X3(g)X3(g)X3100ml(g)下限上限00030001305900026000390010305130011012013020021022023030031032033100101102103110111112113120121122123130131132609012060901201609013016019040V5200701021011015070102301103036015019011030360150200240160200240133200201202203210211
8、2122132202212222232302312322333003013023033103113123133202909010360140303702002601503044020070890270340210404702801001500350420290360440530230401200390701300640150380095043070210075014023001200300380016009301503800333222123150021002900300350440047003333333301232400460011000N240003607101500130002400048000注：本表采用3个稀释度0.1g(mL)、(mL)和0.001g(mL),每个稀释度接种3管。表内所列检样量如改用1g(mL)、(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍：如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。查表注意:在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的1ml(g)，系指原样品的1ml(g)数,并非样品稀释后的1ml(g)数，对固体样品更应注意如固体样品1g经10倍稀释后,虽加入1ml量,但实际其中只含有0.1g样品,故应按0.1g计,不应按1ml计.
