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1、word一、菌体浓度对发酵的影响与控制菌体细胞浓度(cellconcentration)是指单位体积培养液中菌体的含量。无论在科学研究上，还是在工业发酵控制上，它都是一个重要的参数。菌浓的大小，在一定条件下，不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性不完全一样的分化阶段。在发酵动力学研究中，需要利用菌浓参数来算出菌体的比生长速率和产物的比生成速率等有关动力学参数，以研究它们之间的相互关系，探明其动力学规律，所以菌浓仍是一个根本参数。菌浓的大小与菌体生长速率有密切关系。比生长速率大的菌体，菌浓增长也迅速，反之就缓慢。而菌体的生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性有关，不同种类的微生物的生长
2、速率是不一样的。它的大小取决于细胞结构的复杂性和生长机制，细胞结构越复杂，分裂所需的时间就越长。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间分别为45min、90min、3h和6h左右，这说明各类微生物增殖速率的差异。菌体的增长还与营养物质和环境条件有密切关系。营养物质包括各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。按照Monod方程式来看，生长速率取决于基质的浓度(各种碳源的基质饱和系数Ks在110mgL之间)，当基质浓度c(S)10Ks时，比生长速率就接近最大值。所以营养物质均存在一个上限浓度，在此限度以内，菌体比生长速率如此随基质浓度增加而增加，但超过此上限，基质浓度继续增加，反而会引起生长速率下降
3、。这种效应通常称为基质抑制作用。这可能是由于高浓度基质形成高渗透压，引起细胞脱水而抑制生长。这种作用还包括某些化合物(如甲醇、苯酚等)对一些关键酶的抑制，或使细胞结构成分发生变化。一些营养物质的上限浓度(gL)如下：葡萄糖100、NH4+5、PO43-10。在实际生产中，常用丰富培养基，促使菌体迅速繁殖，菌浓增大，引起溶氧下降。所以，在微生物发酵的研究和控制中，营养条件(含溶氧)的控制至关重要。影响菌体生长的环境条件有温度、pH值、渗透压和水分活度等因素。菌浓的大小，对发酵产物的得率有着重要的影响。在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌浓成正比关系，即P=QPmc(X)式中P发酵产物的产率(
4、产物最大生成速率或生产率)，g(Lh)；QPm产物最大比生成速率，h-1；c(X)菌体浓度，gL。菌浓愈大，产物的产量也愈大，如氨基酸、维生素这类初级代谢产物的发酵就是如此。而对抗生素这类次级代谢产物来说，控制菌体的比生长速率比临略高一点的水平，达到最适菌浓即c(X)临，菌体的生产率最高。但是菌浓过高，如此会产生其他的影响，营养物质消耗过快，培养液的营养成分发生明显的改变，有毒物质的积累，就可能改变菌体的代谢途径，特别是对培养液中的溶氧，影响尤为明显。菌浓增加而引起的溶氧下降，会对发酵产生各种影响。早期酵母发酵，会出现代谢途径改变、酵母生长停滞、产生乙醇的现象；抗生素发酵中，也受溶氧限制，使产
5、量降低。如图7-7，为了获得最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。菌体超过此浓度，抗生素的比生成速率和体积产率都会迅速下降。图7-7摄氧速率OUR曲线与传氧速率OTR曲线关系示意图发酵过程中除要有适宜的菌浓外，还需要设法控制菌浓在适宜的X围内。菌体的生长速率，在一定的培养条件下，主要受营养基质浓度的影响，所以要依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。首先要确定根底培养基配方中有适当的配比，防止产生过浓(或过稀)的菌体量。然后通过中间补料来控制，如当菌体生长缓慢、菌
6、浓太稀时，如此可补加一局部磷酸盐，促进生长，提高菌浓；但补加过多，如此会使菌体过分生长，超过c(X)临，对产物合成产生抑制作用。在生产上，还可利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量，以控制菌体的生长和浓度。总之，可根据不同的菌种和产品，采用不同的方法来达到最适的菌浓。 基质对发酵影响与其控制基质即培养微生物的营养物质。对于发酵控制来说，基质是生产菌代谢的物质根底，既涉与菌体的生长繁殖，又涉与代谢产物的形成。因此基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切的关系。所以选择适当的基质和控制适当的浓度，是提高代谢产物产量的重要方法。据Monod方程，在分批发酵中菌体比生长速度是基质浓度的函数。在c(
7、S)Ks的情况下，菌体比生长速率与基质浓度呈线性关系。在正常的情况下，可达到菌体最大比生长速率，然而，由于代谢产物与其基质过浓，而导致抑制作用，出现菌体比生长速率下降的趋势。当葡萄糖浓度低于100150gL，不出现抑制作用；当葡萄糖浓度高于350500gL，多数微生物不能生长，细胞出现脱水现象。就产物的形成来说，培养基过于丰富，有时会使菌体生长过旺，黏度增大，传质差，菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境，即用于非生产的能量大量增加。所以，在分批发酵中，控制适宜的基质浓度不但对菌体的生长有利，对产物的形成也有益处。这里要着重说明碳源、氮源和无机盐等对发酵的影响与其控制。碳源对发酵的影响与其控
8、制碳源，按菌体利用快慢而言，分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。前者(如葡萄糖)能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解代谢产物(如丙酮酸等)，因此有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；后者多数为聚合物(也有例外)，为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的生产期，也为许多微生物药物的发酵所采用。例如，乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油与半乳糖分别是青霉素、头孢菌素C、盐霉素、核黄素与生物碱发酵的最适碳源。因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的。在青霉素的早期研究中，就认识到了碳源的重要性。在迅速利用的葡萄糖培养基中，菌体生长良好，但青霉
9、素合成量很少；相反，在缓慢利用的乳糖培养基中，青霉素的产量明显增加。糖对青霉素生物合成的影响见图7-8。由图可见，糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素。所以缓慢滴加葡萄糖以代替乳糖，仍然可以得到良好的结果。这就说明乳糖之所以是青霉素发酵的良好碳源，并不是它起着前体作用，只是它被缓慢利用的速度恰好适合青霉素合成的要求，其他抗生素发酵也有类似情况。在初级代谢中也有类似情况，如葡萄糖完全阻遏嗜热脂肪芽孢杆菌产生胞外生物素(属同效维生素，vitamer，化学构造与生理作用与天然维生素相类似的化合物)的合成。因此，控制使用能产生阻遏作用的迅速利用的碳源是非常重要的。在工业上，发酵培养基中常采用含迅速利用和
10、缓慢利用的混合碳源，就是根据这个原理来控制菌体的生长和产物的合成。图7-8糖对青霉素生物合成的影响试验 碳源的浓度也有明显的影响。由于营养过于丰富所引起的菌体异常繁殖，对菌体的代谢、产物的合成与氧的传递都会产生不良的影响。假如产生阻遏作用的迅速利用的碳源用量过大，如此产物的合成会受到明显的抑制；反之，仅仅供给维持量的碳源，菌体生长和产物合成就都停止。所以控制适宜的碳源浓度是非常重要的。如在产黄青霉Wis54-1255发酵中，给以维持量的葡萄糖其比消耗速率0.022g(gh)，菌的比生长速率和青霉素的比生成速率都为零，所以必须供给适量的葡萄糖，方能维持青霉素的合成速率。因此，控制适当的碳源浓度，
11、对工业发酵是很重要的。控制碳源的浓度，可采用经验法和动力学法，即在发酵过程中采用中间补料的方法来控制。这要根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式。动力学方法是要根据菌体的比生长速率、糖比消耗速率与产物的比生成速率等动力学参数来控制。氮源对发酵的影响与其控制氮源有无机氮源和有机氮源两类。它们对菌体代谢都能产生明显的影响，不同的种类和不同的浓度都能影响产物合成的方向和产量。如谷氨酸发酵，当NH4+供给不足时，就促使形成-酮戊二酸；过量的NH4+，反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。控制适量的NH4+浓度，才能使谷氨酸产量达到最大。又如在研究螺旋霉素的生物合成中，发现无机铵盐不利于螺旋霉素的合成
12、，而有机氮源(如鱼粉)如此有利于其形成。氮源像碳源一样，也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源。前者如氨基(或铵)态氮的氨基酸(或硫酸铵等)和玉米浆等；后者如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等蛋白质。它们各有自己的作用，快速利用的氮源容易被菌体所利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。如链霉菌的竹桃霉素发酵中，采用促进菌体生长的铵盐浓度，能刺激菌丝生长，但抗生素产量下降。铵盐还对柱晶白霉素、螺旋霉素、泰洛星等的合成产生调节作用。缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的生产期、提高产物的产量是有好处的。但一次投入全量，也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体
13、过早衰老而自溶，从而缩短产物的生产期。综上所述，对微生物发酵来说，也要选择适当的氮源和浓度。发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。如氨基酸发酵用铵盐(硫酸铵或醋酸铵)和麸皮水解液、玉米浆；链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。但也有使用单一的铵盐或有机氮源(如黄豆饼粉)。它们被利用的情况与快速利用和慢速利用的碳源情况相似。为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，除了根底培养基中的氮源外，还要在发酵过程中补加氮源来控制其浓度。生产上采用的方法有如下几种。补加有机氮源根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等。如土霉素发酵中，补加酵母
14、粉，可提高发酵单位；青霉素发酵中，后期出现糖利用缓慢、菌浓变稀、pH值下降的现象，补加生理碱性物质的尿素就可改善这种状况并提高发酵单位；氨基酸发酵中，也可补加作为氮源和pH值调节剂的尿素。补加无机氮源补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机氮源，又可调节pH值。在抗生素发酵工业中，通氨是提高发酵产量的有效措施，如与其他条件相配合，有的抗生素的发酵单位可提高50左右。但当pH值偏高而又需补氮时，就可补加生理酸性物质的硫酸铵，以达到提高氮含量和调节pH值的双重目的。还可补充其他无机氮源，但需根据发酵控制的要求来选择。磷酸盐对发酵的影响与其控制磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成
15、代谢产物所必需的。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32300mmolL，但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmolL，提高到10mmolL，就明显地抑制其合成。相比之下，菌体生长所允许的浓度比次级代谢产物合成所允许的浓度就大得多，两者平均相差几十倍至几百倍。因此控制磷酸盐浓度对微生物次级代谢产物发酵来说是非常重要的。磷酸盐浓度调节代谢产物合成机制，对于初级代谢产物合成的影响，往往是通过促进菌体生长而间接产生的，对于次级代谢产物来说，机制就比拟复杂。磷酸盐浓度的控制，一般是在根底培养基中采用适当的浓度。对于初级代谢来说，要求不如次级代谢那么严格。对抗生素发酵来说，常常是
16、采用生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量)的磷酸盐浓度。其最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和来源等因素，即使同一种抗生素发酵，不同地区不同工厂所用的磷酸盐浓度也不一致，甚至相差很大。因此磷酸盐的最适浓度，必须结合当地的具体条件和使用的原材料进展实验确定。培养基中的磷含量，还可能因配制方法和灭菌条件不同，引起含量的变化。据报道，利用金霉素链霉菌949(S.aureofaciens949)进展四环素发酵，菌体生长最适的磷浓度为6570gmL，而四环素合成最适磷浓度为2530gmL。青霉素发酵，以用0.01的磷酸二氢钾为好。在发酵过程中，有时发现代谢缓慢的情况，还可补加磷酸盐。在四环素发酵中，间歇、微量添加磷酸二氢钾，有利于提高四环素的产量。除上述主要基质
