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1、vww 论文塩表F家 重组中性植酸酶phy (ycD)的表达及其性质【摘要】植酸是豆类、谷类和油料作物等种子中磷的主要储存形式 植酸酶能够水解植酸生成无机磷和磷酸肌醇衍生物，在动物饲料中添 加植酸酶可以有效地提高植酸中磷的利用效率、降低动物排泄物的环 境磷污染,并能通过去除植酸的抗营养作用来提高饲料的营养价值，对 具有高比活和良好热稳定性植酸酶的需求，促进了酶资源的开发利用 以及植酸酶基因工程和蛋白质工程研究,也为更好应用于实践生产奠 定基础。中性植酸酶也称P-螺旋桨植酸酶，主要来源于芽抱杆菌，是耐 热性较好，最适反应pH呈中性(pH7.0-7.5),能够分解植酸释放磷元素, 并且与金属离子
2、有关的一类酶,尤其是Ca2+对于植酸酶酶活性及稳定 性起到至关重要的作用。这一类植酸酶可在鲤科鱼类及单胃动物等 pH值呈中性的肠道中起作用,而酸性植酸酶在中性pH条件下活性基 本丧失,因此，中性植酸酶弥补了酸性植酸酶性质上的不足，可提高植 酸酶在动物胃肠道的效用，拓宽植酸酶的应用范围。本文对前期已克 隆到的中性植酸酶基因phy(ycD)进行表达纯化及性质研究，主要结果 如下：将phy(ycD)基因连接到带有T7lac启动子的pET-28a(+)表达载 体上,构建了原核表达质粒pET-28a(+)-phy(ycD),并在大肠杆菌 BL21(DE3)中用IPTG在16C下进行了诱导表达，利用Ni-
3、NAT亲和层 析的方法纯化获得的融合蛋白r-phy(ycD),经SDS-PAGE分析和表达 产物的研究表明：经诱导表达的酶蛋白几乎以可溶的形式存在，占可 溶性蛋白的40%以上，纯化后蛋白纯度达90%以上，在SDS-PAGE胶上显示大小为45kDa的条带，酶活测定表明表达产物具有酶活性。对 纯化后的植酸酶的酶学性质进行分析，该酶最适Ca2+浓度为ImM,其 酶促反应的最适pH为6.5，最适反应温度为45C,Km值和Vmax值分 别为 0.213mM 和 92.6nmolmg-lproteins-l。在 65C、pH6.5 和浓度为 1mMCa2+条件下处理20min,与 37C时相比,残余酶活为
4、30%；在 pH6.5、37C和浓度为lmMCa2+条件下处理lh,残余酶活为60%；在 60C、pH6.5条件下孵育不同的时间,10mMCa2+浓度酶蛋白明显比0、 1和5mMCa2+浓度酶蛋白的热稳定性好；该酶是Ca2+依赖性酶,1.0mMCa2+能显著提高酶蛋白的热稳定性和pH稳定性,EDTA、 Zn2+、Ba2+和Fe2+对酶促反应均有显著抑制作用。综上所 述,r-phy(ycD)酶学性质预示其在水产养殖业中的应用潜力，也为中性 植酸酶产品的工业化生产奠定基础。因此，本研究具有重要的理论意 义和实际应用价值。【关键词】中性植酸酶基因表达酶学性质【学位授予单位】山西大学【学位级别】硕士【
5、学位授予年份】2013【分类号】Q78【目录】 中文摘要12-14ABSTRACT14-16第一章文献综述16-231.1植酸161.2植酸酶16-181.2.1植酸酶的定义16-171.2.2植酸酶的分类 17-181.3中性植酸酶18-211.3.1中性植酸酶的来源18-191.3.2中性植 酸酶一般酶学性质191.3.3中性植酸酶的结构和催化机制19-201.3.4 中性植酸酶大肠杆菌表达系统201.3.5中性植酸酶的应用20-211.4本 论文设计思路21-231.4.1本课题立题依据及研究进展21-221.4.2本研 究的目的及意义22-23第二章植酸酶基因phy(ycD)的原核表达
6、及纯化 23-432.1实验材料23-262.1.1菌株和质粒232.1.2用于大肠杆菌表达 的引物232.1.3主要试剂及溶液配制23-262.1.4主要实验仪器262.2 实验方法26-342.2.1中性植酸酶基因phy(ycD)的克隆26-272.2.2中性 植酸酶基因的亚克隆27-282.2.3植酸酶基因phy(ycD)PCR扩增产物与 载体pGEM-T-easy的连接与转化282.2.4感受态细胞 (Escherichiacoli)DH5的制备与转化 28-292.2.5重组质粒的提取 292.2.6重组质粒的酶切鉴定29-302.2.7阳性克隆的测序302.2.8植酸 酶基因phy
7、(ycD)表达载体的构建30-312.2.9重组质粒的鉴定312.2.10 阳性表达子的筛选31-322.2.11表达载体pET-28a(+)-phy(ycD)在在大 肠杆菌BL21(DE3)中的大量诱导表达322.2.12表达产物的酶活性测定 32-332.2.13蛋白的纯化332.2.14表达产物的SDS-PAGE分析33-342.3 结果与分析34-412.3.1克隆获得中性植酸酶基因及其序列测定 34-352.3.2芽抱杆菌BacillussubtilisYCD植酸酶的信号肽切割位点预 测35-362.3.3芽抱杆菌BacillussubtilisYCD植酸酶的结构模拟36- 372.
8、3.4芽抱杆菌BacillussubtilisYCD植酸酶蛋白的二级结构分析37- 382.3.5中性植酸酶基因phy(ycD)的 PCR扩增382.3.6表达载体 pET-28a(+)-phy(ycD)的构建 38-392.3.7 重组质粒 pET-28a(+)-phy(ycD) 的酶切鉴定39-402.3.8中性植酸酶基因阳性表达子的筛选402.3.9表 达产物的SDS-PAGE结果40-412.3.10凝胶过滤层析结果412.4讨论 41-43第三章重组植酸酶phy(ycD)的性质43-593.1实验材料 43-443.1.1主要生化试剂433.1.2主要试剂的配制43-443.1.3主
9、要实验 仪器443.2实验方法44-503.2.1钼蓝法测定植酸酶酶活性的方法 443.2.2无机磷标准曲线的绘制443.2.3采用Bradford试剂盒法测定植 酸酶蛋白的浓度44-453.2.4重组植酸酶比活的测定453.2.5Ca(2+)对 酶活性的影响453.2.6最适酶促反应pH的测定453.2.7中性植酸酶pH 稳定性45-463.2.8中性植酸酶最适反应温度463.2.9中性植酸酶热稳 定性463.2.10Ca(2+)对纯r-phy(ycD)热稳定性的影响46-473.2.11 一级 反应时间与动力学参数的测定47-483.2.12纯酶r-phy(ycD)圆二色谱 检测48-49
10、3.2.13不同化学试剂及金属离子对植酸酶活性的影响49- 503.3实验结果50-573.3.1无机磷标准曲线的绘制503.3.2蛋白浓 度标准曲线的绘制503.3.3纯酶r-phy(ycD)比活性的测定50- 513.3.4Ca(2+)对酶活性的影响51-523.3.5酶活最适pH及pH稳定 性523.3.6最适酶促反应温度及其热稳定性 52-533.3.7不同浓度 Ca(2+)对纯r-phy(ycD)热稳定性的影响53-543.3.8重组植酸酶 r-phy(ycD)热恢复分析543.3.9动力学常数的测定 54-553.3.10r-phy(ycD)圆二色谱检测553.3.11不同金属离子和化学试 剂对纯r-phy(ycD)活性影响55-573.4讨论57-59参考文献59-65总结 与展望65-68附录I68-69附录II69-70攻读学位期间取得的研究成果 70-71致谢71-72个人简况及联系方式72-74 本论文购买请联系页
