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1、细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院 风湿科 李 晶K返回主页一、细胞冷冻保存1. 材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4% (w/v) trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRY010SeriesII)2、冷冻保存方法：(1 )传统方法：冷存管置于4C10分钟-20C30分钟-80C1618小时(或隔夜)-液氮槽vaporphase 长期储存。-20C不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入
2、80C冰箱中，惟存 活率稍微降低一些。(2) 程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3C/分钟之速度由室温降至(-80C以下)-120C，再放 在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：(1) 冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。(2) 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜DMS0)至20% 浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。(3) 离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前 存活率。(4) 取与细胞悬
3、液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液0MS0最后浓度为 510%)，使细胞浓度为15X106ells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，12ml/vial，并取 少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：(1) 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为8090%致密度。冷冻前检测细胞是 否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。(2) 细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。(3) 注意冷冻保护
4、剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直 接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以510ml小体积分装，4C避光保存，勿作多次解冻。Glycero 1亦应为试剂 级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻 存液，可避免DMS0直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细 胞受损。DMS0可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。(4) 冷冻保存之细胞浓度： normal human fibroblas t:13X
5、10ece11s/m1 hybridoma:13X106cells/ml,细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死 去。 adherenttumorlines:57X106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1 3X106cells/ml other suspensions:510X106cells/ml, human lymphocyte 须至少 5X106cells/ml。(5) 冷冻保护剂浓度为5或10%DMS0,若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup cul ture，以防止冷
6、冻失败。(6) 冻存可用10%90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而 少沉积(4度时) ，复苏存活率在80%90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它 蛋白质)。3、材料37C恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：(1) 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。(2) 自液氮或干冰容器中取出
7、冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。(3) 将新鲜培养基置于37C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。(4) 取出冷冻管，立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存 管外部，移入无菌操作台内。(5) 取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:101:15),混合均匀，放入C02 培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。(6) 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMS 0或glycerol),依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即 去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻
8、之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm, 5分 钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入C02培养箱培养。(7) 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：(1) 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。(2) 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1 mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻 16个小格，深度均为0.1mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2X0.1mm=1.0x10-4ml。使用 时，计数每个大
9、正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104,即为每ml中之细胞数目。(3) 存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗 入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosin bluish。 计算细胞活率：活细胞数/ (活细胞数+死细胞数)X100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分 活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoB
10、RL15250-061)； Erythosin bluish stain； 取 0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preserva tive met hyl paraben(SigmaH-3647)溶于 100mlCa+/Mg+freesaline； 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器 (Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。3、步骤：(1) 取50卩l细胞悬浮液与50ul try
11、pan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。(2) 取少许混合液(约15卩l)自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察， 活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Ery throsin bluish)。(3) 计数四个大方格之细胞总数，再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合)，最后乘 以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数X稀释倍数X104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cmX0.1c
12、mX0.01cm=104ml计数板计数时，最适浓度为510X105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释 或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少 许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75X 104X2 (稀释倍数)=1.22X 106；细胞数/flask(10ml)：1.22X 106X 10ml=12.2X106存活率：225/243= 92.6%
