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1、细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院 风湿科 李 晶K返回主页一、细胞冷冻保存1. 材料:生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4% (w/v) trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRY010SeriesII)2、冷冻保存方法:(1 )传统方法:冷存管置于4C10分钟-20C30分钟-80C1618小时(或隔夜)-液氮槽vaporphase 长期储存。-20C不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入
2、80C冰箱中,惟存 活率稍微降低一些。(2) 程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1-3C/分钟之速度由室温降至(-80C以下)-120C,再放 在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤:(1) 冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。(2) 配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜DMS0)至20% 浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。(3) 离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前 存活率。(4) 取与细胞悬
3、液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液0MS0最后浓度为 510%),使细胞浓度为15X106ells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,12ml/vial,并取 少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项:(1) 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为8090%致密度。冷冻前检测细胞是 否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。(2) 细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。(3) 注意冷冻保护
4、剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直 接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以510ml小体积分装,4C避光保存,勿作多次解冻。Glycero 1亦应为试剂 级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻 存液,可避免DMS0直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细 胞受损。DMS0可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。(4) 冷冻保存之细胞浓度: normal human fibroblas t:13X
5、10ece11s/m1 hybridoma:13X106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死 去。 adherenttumorlines:57X106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1 3X106cells/ml other suspensions:510X106cells/ml, human lymphocyte 须至少 5X106cells/ml。(5) 冷冻保护剂浓度为5或10%DMS0,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup cul ture,以防止冷
6、冻失败。(6) 冻存可用10%90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而 少沉积(4度时) ,复苏存活率在80%90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它 蛋白质)。3、材料37C恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤:(1) 操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。(2) 自液氮或干冰容器中取出
7、冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。(3) 将新鲜培养基置于37C水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。(4) 取出冷冻管,立即放入37C水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存 管外部,移入无菌操作台内。(5) 取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:101:15),混合均匀,放入C02 培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。(6) 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMS 0或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即 去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻
8、之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm, 5分 钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入C02培养箱培养。(7) 若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理:(1) 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。(2) 血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1 mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻 16个小格,深度均为0.1mm。当chamber 上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1 mm2X0.1mm=1.0x10-4ml。使用 时,计数每个大
9、正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。(3) 存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗 入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料,如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosin bluish。 计算细胞活率:活细胞数/ (活细胞数+死细胞数)X100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分 活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。2、材料:0.4%w/v trypan blue(GibcoB
10、RL15250-061); Erythosin bluish stain; 取 0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preserva tive met hyl paraben(SigmaH-3647)溶于 100mlCa+/Mg+freesaline; 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器 (Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。3、步骤:(1) 取50卩l细胞悬浮液与50ul try
11、pan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。(2) 取少许混合液(约15卩l)自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察, 活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Ery throsin bluish)。(3) 计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘 以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注:4大格细胞总数X稀释倍数X104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cmX0.1c
12、mX0.01cm=104ml计数板计数时,最适浓度为510X105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释 或连续稀释后计数。5、范例:T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中,取少 许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;细胞数/ml:60.75X 104X2 (稀释倍数)=1.22X 106;细胞数/flask(10ml):1.22X 106X 10ml=12.2X106存活率:225/243= 92.6%