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1、用 FACScan 流式细胞仪测定丽娃河水中异养细菌实验报告姓名：毕倩倩 学号：51102601010 专业：海洋化学 指导老师：邓鸿 实验目的1. 了解流式细胞仪的测量原理及用途2. 掌握流式细胞仪的实验操作及数据处理方法流式细胞仪的基本结构和工作原理FACScan流式细胞仪主要由以下五部分构成： 流动室及液流驱动系统； 激光光源及光束形成系统；光学系统；信号检测与存储、显示、分析系 统；细胞分选系统。工作原理：单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔 径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞 成单行排列依次通过激光检测区。在激光光源和流动室之间
2、有两个圆柱形透镜， 将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光 束（20mX 64卩m）,使通过激光检测区的细胞受照强度一致。流式细胞仪的光 学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，透镜和小孔使通过激光检测区的细胞 受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰；滤光片的主要作用是将不同波长 的荧光信号送到不同的光电倍增管。将这些电信号传输到计算机上进行分析。另 外,细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有 一个超高频电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,将这些液滴 充以正负不同的电荷,当液滴流经带有几千伏特的偏转板时,在高压电场的作用
3、下偏转,落入各自的收集容器中,就达到分选的目的了。本实验中测定水样中异养细菌的数目,由于细菌本身不能产生荧光,所以要 对其进行染色，由于细菌都有DNA，所以一般情况下，DNA成为染色目标物。实验仪器及材料1. 实验仪器及设备：美国 Becton Dickinson 公司流式细胞仪 FACSCan， CellQuest 软件-Apple操作系统.1000L移液枪和枪头、10L移液枪和枪头，滤膜筛 绢。2. 实验材料：丽娃河水、 SYBR Green I 染料（染料浓度为万分之一，密封低温 避光保存）、 Milli-Q 水实验步骤1. 开机：先打开鞘液桶，装满 Milli-Q 水，另外要清理废液桶
4、。打开主机开关， 检查各气路是否通，待Standby按钮显橙色。再打开计算机主机和显示器。2. 水样预处理：用筛绢过滤丽娃水样，润洗几次。用1000L移液枪移取990 L水样和10L染色剂SYBR Green I与一次性无菌试管中。染色15分钟。3. 打开Cellqust软件，将仪器与计算机相连，设定仪器各个参数阈值200,电压FL1 650 等。4. 一切准备好后，就可以测样了，先用 Milli-Q 水冲洗，然后将样品混合均匀后 放在测试位置上（注意要卡住），新建一个文件，命名好，保存，设定测定 时间为60s、流速为60p L/min,最后，停止测量时，采集数据，用SSC-H 作为横坐标， FL-1 作为纵坐标，作图，然后用曲线将染色的细胞群圈定，可 以得到该区域的细胞总数。5. 关机：将仪器清洗后，倒掉废液桶。关闭软件，关闭流式细胞仪，关闭计算 机。数据记录、计算及结论Cell evens=310049则 1ml 待测样品中细胞总数为=5.17 x106310049 xl03 卩 L60 卩 L / minx lmin则990L丽娃水样中的细胞数为：5.17x106个因次，该实验中用流式细胞仪测量到的丽娃水样中异养细菌数目为5.22x106ml-1
