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1、实验二 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定【实验目的】 了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义。【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、 胡萝卜素和叶黄素组成。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可用丙酮或乙醇将它们从叶片 中提取出来。叶绿素与类胡萝卜素都有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计 精确测定。叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光；叶绿素中的镁可被H+取代而生成褐色的 去镁叶绿素；加入铜盐作用，后者则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不 易破坏，故常用此法制作绿色植物的浸渍标本。【器材与试剂】1
2、. 实验仪器 分光光度计、电子天平、研钵、漏斗、滤纸、容量瓶、试管、剪刀等2. 实验试剂 95%乙醇、醋酸铜、盐酸、石英砂、碳酸钙3. 实验材料 新鲜植物叶片【实验步骤】1. 色素的提取 取新鲜叶片，剪去粗大叶脉并剪成碎块，称取O.lg左右放入研钵中加 入95%乙醇lml,少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，然后以漏斗过滤之，并用适量95% 乙醇反复冲洗研钵和滤纸，滤液收集于25ml容量瓶中，最后定容备用。2. 测定光密度 取上述提取液 5ml 左右转入比色杯中，以 95%乙醇为对照，分别测 定 665nm、 649nm 和 470nm 处的光密度值。3. 按下面公式分别计算色素提取液中叶绿素a、
3、叶绿素b、类胡萝卜素的浓度，然后分 别计算每克鲜重叶片中色素的含量。Ca = l3.95A665- 6.88A649Cb = 24.96A649- 7.32A665Cx.c = (l000A470- 2.05Ca - ll4.8Cb) / 245其中Ca为叶绿素a浓度，Cb为叶绿素b浓度，Cx.c为类胡萝卜素浓度。4. 叶绿素的荧光现象 取上述色素提取液少许于试管中，分别观察在反射光和透射光 一侧，提取液的颜色有无不同。反射光侧观察到的血红色，即为叶绿素产生的荧光颜色。5. 铜代反应 取上述色素提取液少许于试管中， l 滴 l 滴加浓盐酸，直至溶液出现褐 绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加入醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶 液，则又产生鲜亮的绿色，此即形成了铜代叶绿素。【注意事项】由于叶绿素a、叶绿素b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误 差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。【思考题】1. 为什么提取叶绿素时干材料一定要用 95%乙醇而新鲜材料则可以用无水乙醇提取？2. 叶绿素 a 和叶绿素 b 在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收 峰波长进行叶绿素a和叶绿素b的定量分析，为什么？
