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1、烟草及烟草制品 西柏烷二萜醇的测定气相色谱-质谱联用法研究报告项目组2012年7月烟草及烟草制品 西柏烷二萜醇的测定气相色谱-质谱联用法1 概 述烟叶的吃味品质主要受化学成分、物理性状等因素影响，其中化学成分作为物质基础是 决定性因素。多年来，烟草化学家试图从烟草化学成分含量及其相互关系得到评价烟草品质 的客观指标，如还原糖、总糖、烟碱、总氮、淀粉、石油醚提取物等常规指标。人们对烟叶香味成分和致香前体物质的研究发现，与常规化学成分相比，烟草表面物质 包括二萜、糖酯等组分的含量对烟草香味品质具有更重要作用。洗涤去除烟叶表面物质后烟 叶香味和吃味明显减弱，同时增加了苦涩味。而将烟叶表面物质加回洗涤
2、后的烟叶上，烟叶 的香味和吃味即可恢复。西柏烷二萜醇是烟草表面物质的主要成分，文献报道鲜烟叶中西柏 烷二萜醇含量占叶面总脂类物质的 50%，可占叶鲜重的0.7%。烟草表面含量较高的西柏烷二 萜醇的结构如图1所示，化学名分别为a（卩）-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（a（卩）-cembrenediol, a（卩） -CBD）。a-CBD 和卩CBD 为差向异构体，a-CBD 的绝对构型为（1S,2E,4S,6R,7E,11E）-2,7,11- 西柏三烯-4,6-二醇，P-CBD的绝对构型为（1S,2E,4R,6R,7E,11E）-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇。图1 （l）a-2,
3、7, 11-西柏烷三烯-4, 6-二醇（2）卩-2, 17, 11-西柏烷三烯-4, 6-二醇西柏烷二萜醇在调制、陈化以及燃烧过程中容易发生氧化和降解，产生多种降解产物， 如茄酮、茄醇和降茄二酮等，而这些降解产物被认为是非常重要的烟草香味成分。西柏烷二 萜醇的含量和烟草的品质被普遍认为成正相关关系。添加有西柏烷二萜醇的卷烟与对照样相比具有可可香味，余味干净，吃味丰满，较高含量的添加可产生轻微的花香韵，较低含量的 添加则产生淡薄的粉香韵。鉴于西柏烷二萜醇等烟叶表面化合物的重要性，一些分析方法被开发出来用于烟叶表面 化合物的检测。其中，气相色谱应用最为广泛。采用的检测器有火焰离子化检测器（FID）
4、和 质谱检测器（MS）。但是a-CBD和P-CBD是差向异构体，需要经过衍生化之后才能在色谱柱 上分离开，否则，两种异构体会于同一保留时间流出，因此用气相色谱分离a-CBD和P-CBD 通常需 要 衍生化处理。 目前报道的 衍生化 方法主要 有两种 ：第一种 是以 N,O-bis（trimethyl）trifluoroacetamide （BSTFA）为衍生化试剂，二萜上的活泼氢被三甲基硅取代。 第二种是利用丁基硼酸和吡啶于100C加热15min衍生化a-CBD和卩-CBD,硼酸的两个羟基 与这两种西柏烷二萜的两个羟基脱水反应。2004 年，结合国家局科技项目烟草表面重要二萜类物质与烟草品质特
5、征关系的研究， 郑州烟草研究院通过三年的研究工作，对烟草表面化合物进行了全面系统的分析，在国内首 次提取了烟草表面二萜类化合物的纯品并采用质谱和核磁共振技术对其结构进行了鉴定；建 立了烟草主要表面化合物的定量分析方法，并对烟草表面物质与烟草品质特征的关系进行了 研究。在该项目中建立了一种利用GC/MS技术应用于烟草中两种西柏烷二萜（a-CBD和 P-CBD）分析的BSTFA衍生化分析方法。在该项目研究基础上，本项目组对分析方法进行进一步优化、验证，建立了一种测定烟 叶表面主要致香物质前体西柏烷二萜醇的可靠方法。2.实验2.1.仪器与试剂HP6890/5973 型气相色谱质谱联用仪；色谱柱： D
6、B-5 MS 柱，规格为 30mx0.25mmx0.25pm；二氯甲烷（分析纯）；二甲基甲酰胺（DMF，分析纯）；正十七烷醇， N,O-双三甲基三氟乙酰胺（BSTFA）（美国Acros Organics公司，纯度98%）、a-2,7,11-西柏三烯 -4,6-二醇（自制，纯度97%）、卩-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（自制，纯度95%）。2.2 溶液配制2.2.1 内标溶液的配制准确称取约250mg正十七烷醇到50mL的容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，该溶液为 内标溶液。222 a-CBD和卩-CBD标准溶液的配制分别准确称量约30mg a-CBD和10mg的卩-CBD置于10mL棕色
7、容量瓶中，加入二氯甲烷 溶解并稀释至刻度，该溶液为储备液。分别准确移取40yL、1OOyL、200yL、400yL、8OOyL、1600yL的储备液至10mL棕色容 量瓶中，再准确加入200yL内标储备液，稀释至刻度，此六个标准溶液为系列标准溶液。2.2.3 提取溶液配制准确移取2.00mL内标储备溶液至1000mL容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，得到提取 溶液。2.3 样品处理和分析2.3.1 样品处理准确称取0.5g烟末(精确至0.001g),置于100mL锥形瓶中，加入50mL提取溶液，超声 振荡10min后，用装有5g无水硫酸钠的滤纸滤去烟末。取10mL滤液至浓缩瓶中，在500mba,
8、 40C的条件下浓缩去除溶剂。加入lOOOyL 1:1 (v/v) BSTFADMF，洗涤浓缩瓶器壁，将所得 溶液转入色谱瓶。在75C水浴中进行衍生化反应60min，得到GC/MS分析样品溶液。2.3.2 气相色谱-质谱条件进样口温度：250 C；电离方式： EI；离子源温度： 230C；传输线温度： 280C；进样量：1pL；分流进样，分流比： 10:1；载气：氦气，恒流模式，流量1 mL/min；程序升温：初始温度150C,以200 min的速率升温至215C,再以0.5Q min的速率升至220C,最后以10C/ min的速率升至290C,在290C后运行20min。扫描方式：选择离子监
9、测(SIM)；选择离子：内标离子m/z=313； a萜醇和卩萜醇离子m/z=169。每个离子的监测时间 为 50ms。3. 结果与讨论3.1 烟草中主要二萜和蔗糖酯的定性由于标准质谱库中没有衍生后的a-CBD和卩-CBD的标准谱图，通过与纯品的保留时间 和MS谱图比较对烟草样品中a-CBD和P-CBD进行定性确认。图1 a-CBD和P-CBD衍生后的总离子流图(1a-CBD 2. 0-CBD)图1为a-CBD和P-CBD标准样品衍生后的总离子流色谱图，在10.69和11.81min两处 的色谱峰分别是a-CBD和卩-CBD。图2为烟草样品的总离子流色谱图，可以看出烟草样品在10.69 和11.
10、81min处也存在两个典型的色谱峰Abundancem /z - 4500004000003500003000002500002000001500001000005 000 0图3 aCBD标准品（衍生化）质谱图AbundanceScan 6 5 3 ( 1 0.6 8 9 m in): 1 -1.Dm /z - 8000007000006000005000004000003000002000001000004,29吗，即1733,9.門-0,38 | , 407，435 十,1 001 50200250300350400450图4烟草样品10.7 min处的质谱图an712000001100
11、00010000009000008000007000006000005000001694000001330000012000007100000005 02 32 11 4b 6S c4 5 02 0 02 5 01 0 015 0782(11.798 m in): 6 . D3 804 10F 4 3F3 0 03 5 04 0 079IX1 10m / z图5 0CBD标准品（衍生化）质谱图Abundance图 6 烟草样品 11.8min 处的质谱图图3为a-CBD标准品衍生化后的质谱图，图4为烟草样品相同保留时间（10.7min）色谱 峰的质谱图。由质谱图可以看出，二者的主要碎片离子和相
12、对丰度高度一致，可以认为烟草 样品色谱图中10.7min处的色谱峰为a-CBD的衍生物。同样，图5为卩-CBD标准品衍生化后 的质谱图，图6为烟草样品相同保留时间（10.8 min）色谱峰的质谱图，二者的主要碎片离子 和相对丰度高度一致，可以认为烟草样品色谱图中11.8min处的色谱峰为P-CBD的衍生物。3.2样品处理条件优化3.2.1 衍生化条件的选择3.2.1.1衍生化介质的选择衍生化介质是衍生化反应的的外部环境，衍生化介质必须要对衍生化试剂和被衍生化物 质具有良好的溶解性，因此衍生化介质的选择直接关系到衍生化反应的进行。结合文献报道 选用二甲基甲酰胺、三氯甲烷和甲苯3种衍生化介质进行比
13、较，结果如表1：表 1 不同衍生化介质对衍生化反应的影响 a目标物三氯甲烷二甲基甲酰胺甲苯a-CBD1.0311.8920.238P-CBD0.0660.5660.062注：a表中数据为目标化合物与内标峰面积之比，下同。表 1 结果表明，不同的衍生化介质对衍生化效果影响较大。在选择的三种介质中，二甲 基甲酰胺的衍生化效果要明显好于三氯甲烷和甲苯。因此，本实验选二甲基甲酰胺作为衍生 化的介质。3.2.1.2 衍生化介质与衍生化试剂比例的选择 一般情况下，加入的衍生化试剂的量越大衍生化效果越好。固定衍生化介质与衍生化试剂 的总体积为lOOOyL，改变两者的量得到不同衍生化介质与衍生化试剂的比例。考
14、察了35:15、 30:20、25:25和20:30(v/v)对衍生化反应的影响，结果如表2：表2不同衍生化介质与衍生化试剂的比例(v/v)对衍生化反应的影响目标物35:1530:2025:2520:30a-CBD1.4721.4901.7921.788卩-CBD0.4170.4280.5260.515由表 2 可以看出，随着衍生化介质与衍生化试剂比例的减小，衍生化的效果逐渐变好。 综合考虑两种目标物的衍生化效果，当两者的比例为 25:25 时，衍生化效果最好。因此，本 实验选衍生化介质与衍生化试剂比例为 25:25。3.2.1.3 衍生化温度的选择衍生化温度是影响衍生化反应的一个重要因素。衍生化温度过低，衍生化反应速率太慢 反应时间过长。衍生化温度过高，可能会引起衍生化试剂或被衍生化物质的分解。分别选45C、 55C、65C、75C、85C、95C衍生化温度进行比较，结果如表3：表 3 不同衍生化温度对衍生化反应的影响目标物45 C55 C65 C75 C85 C95 Ca-CBD1.2841.5381.7921.8211.6941.668P-CBD0.1600.3300.5260.5400.5550.493由表3可以
